年关将近，17+SCI的干湿结合套路超实用示范，按模板来抄作业啦！
领略高端套路，发表高分文章！
小伙伴们大家好，我是菠小萝。今天为大家带来的是一篇发表在《J Hematol Oncol》上的文章，题目是“A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties”，影响因子：17.388。这本期刊今年的影响因子也是飞速飙升~本篇范文是一个新的主变量分子——lncRNA ROPM。
本研究的疾病是乳腺癌，就不多介绍了。新的主变量分子是比较创新的lncRNA ROPM。
肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)又称肿瘤起始细胞(tumor- initiation cell)，是具有自我更新、肿瘤起始和肿瘤维持能力的肿瘤细胞亚群，被认为是肿瘤发生、发展、复发、转移和化疗耐药的“种子”。因此，研究维持CSC特征的机制可能为乳腺癌治疗提供新的策略。
自Otto Warburg在20世纪20年代首次观察到Warburg效应以来，代谢重编程已成为肿瘤细胞的标志。作者前期通过微阵列分析在乳腺CSCs和非CSCs之间发现了一种新的与代谢相关的lncRNA，被称为lncROPM(磷脂代谢调控因子)，被预测以磷脂代谢相关的PLA2G16为靶点。PLA2G16在卵巢癌、胃癌、结肠癌和直肠癌等中的作用均有报道。PLA2G16后来被归类为磷脂酶A2家族成员，并通过催化磷脂sn-2酯键的水解参与磷脂代谢。而磷脂的sn-2位置通常富含花生四烯酸(AA)等不饱和脂肪酸，是重要的细胞代谢物，介导肿瘤发生发展的各种信号转导。此外，PLA2G16在脂肪组织中过表达，促进脂肪细胞脂解，说明PLA2G16对脂质代谢有很大的影响。
我们总体看一下文章的逻辑框架。首先，文章的主变量是作者应用芯片技术鉴定乳腺CSCs (BSCSs)中的创新分子lncROPM(磷脂代谢调节因子)，并对乳腺癌细胞和组织中的BSCSs进行qRT-PCR验证。通过生物信息学在两个乳腺癌队列和TANRIC数据库(TCGA-BRCA, RNAseq数据)中评估lncROPM的临床意义。
随后，RNA FISH、RNA pull-down、荧光素酶报告基因检测和放线菌素D处理研究lncROPM的调控机制。在体外和体内进行了“一正一反”的双操作，即功能增加和功能丧失的检测，以研究lncROPM在BSCSs中的作用。采用UHPLC-QTOFMS系统检测PLA2G16介导的磷脂代谢。CCK8法检测细胞化疗敏感性。
结果发现LncROPM在BSCS中高表达。lncROPM增强存在于临床乳腺肿瘤及其他实体肿瘤中，与乳腺癌患者的恶性分级/分期及预后不良呈正相关。接下来，lncROPM在体外和体内都是维持BSCSs特性所必需的。在机制上，lncROPM通过直接结合PLA2G16的3 ' -UTR来调节PLA2G16的表达，增加mRNA的稳定性。增加的PLA2G16显著促进BSCSs的磷脂代谢和游离脂肪酸(尤其是花生四烯酸)的产生，从而激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号通路，最终参与BSCSs干细胞的维持。重要的是，lncROPM和PLA2G16显著促进了BSCSs的化疗耐药。使用临床治疗药物如阿霉素、顺铂或他莫昔芬联合Giripladib(一种胞浆磷脂酶A2抑制剂)可有效消除BSCSs和肿瘤发生。本研究强调了lncROPM及其靶细胞PLA2G16在维持BCSC特性方面发挥着关键作用，并可能作为BCSC或其他癌症干细胞的生物标志物。
一、表达差异
1
与代谢相关的lncROPM在bscs中高表达
图1
首先，了解一下本片范文中涉及的科研常识：CD44+CD24−/低水平的乳腺癌细胞具有干细胞特性，被称为乳腺csc样细胞或乳腺癌干细胞(BSCSs)。
为了研究lncRNA是否参与调节乳腺癌干细胞的特性，作者利用芯片分析比较了MCF7细胞的非BSCSs (CD44−/低CD24+细胞)和BSCSs (CD44+CD24−/低乳腺球)之间的lncRNA表达谱。如所示，共发现585个lncRNA转录本存在差异表达(图1A),然后进行qRT-PCR。生信分析预测了23个与BSCSs代谢通路相关的lncRNA(图1B)。于是，就发现了新的主变量lncROPM(磷脂调节因子)在BSCSs中高表达，位于染色体11q12.3-q13.1与附近的基因PLA2G16。qRT-PCR分析其在各种乳腺癌细胞，以及该细胞中的BSCSs和非BSCSs中的水平均有表达差异。并且，lncROPM在高侵袭性细胞(MDA-MB-231, Hs578T, BT549, MDA-MB-436)中的表达明显高于低侵袭性细胞(MDA-MB-453, MCF7, T47D, BT474)。
随后，Transwell侵袭实验也证实lncROPM在这些被入侵细胞中高度表达，这些细胞的CD44+/CD24−/低亚群细胞也比亲代细胞高。同样，lncROPM在BSCSs中比在非BSCSs中要高得多(图1C)。这些结果提示lncROPM可能与乳腺癌的恶性相关，并在BSCSs中发挥作用。此外，RNA荧光原位杂交(FISH)和亚细胞分离实验均显示lncROPM主要存在于BSCSs的细胞质中(图1D、E)。
二、临床意义
1
TCGA预测LncROPM在乳腺肿瘤临床特征
图2
为了进一步确定lncROPM在乳腺癌中的临床意义，作者首先从TCGA-BRCA数据库(RNAseq数据)中检测了其在患者中的表达。如图2A所示，死于乳腺癌患者(n = 120)的lncROPM平均水平高于存活患者(n = 705) (p < 0.05)(图2A)。Kaplan-Meier生存分析显示，基于3年无病生存期和无进展生存期较差，lncROPM水平高与患者预后不良显著相关(图2B、C)。接受治疗的ER−PR−Her2−患者中lncROPM的表达与无病生存率和无进展生存率呈负相关(图2D, E)，表明lncROPM与耐药相关。随后，作者通过qRT-PCR检测了50对乳腺癌组织和相邻正常组织中lncROPM的表达。如图2F所示，与癌旁正常组织相比，乳腺癌组织中lncROPM明显上调。在另一组130例乳腺癌病例中，作者评估了lncROPM表达与临床病理因素的相关性（图2G&表1）。
三、分子机制
（一）间接机制
1
LncROPM与肿瘤干细胞密切相关
由于肿瘤中的CSC干性与组织学分级所反映的致癌脱分化有关。作者分析了lncROPM表达与乳腺肿瘤组织中CSC干性标志物的关系。发现与乳腺肿瘤组织中Sox2、Oct4和ALDH1A1的表达呈正相关(图2H、I)。同时， qRT-PCR检测非BSCSs和原代乳腺癌细胞中lncROPM的表达，发现与非BSCSs相比，BSCSs中lncROPM明显升高，尤其是在肿瘤高级别组(图2J)。此外，作者观察到，相对于化疗敏感肿瘤组织，lncROPM在化疗耐药乳腺肿瘤组织中显著升高(图2K)。
2
LncROPM是维持BCSC干细胞特性的功能性验证
图3
为了探究lncROPM在BSCSs中的功能，lncROPM被两个慢病毒介导的短发夹RNA (shRNAs)敲除(图3A)，异位的lncROPM用携带慢病毒的lncROPM转染到非BSCSs中(图3B)，减小了球体尺寸(图3C)，并降低了连续传代过程中的自我更新能力(图3D-E)，以及在串联传代中乳腺巨细胞球的形成效率(图3F)。
接下来的体外和体内的限制性稀释分析，检测了lncROPM对肿瘤起始电位的影响。发现lncROPM缺乏明显削弱了体外和体内的肿瘤启动能力(图3G-H)，异位的lncROPM可以使非cscs具有肿瘤启动能力(图3I-J)。综上所述，这些数据表明lncROPM有助于BCSC的特性。
（二）直接机制
1
靶向位点验证
图4
为了探究lncROPM调控BSCSs特性的潜在机制，就是交互靶向位点验证。首先是生物信息学分析分析了一下可能存在的靶点，以及qRT-PCR预测lncROPM的潜在靶基因是PLA2G16。
为了进一步检测lncROPM是否会影响PLA2G16的表达，分别在不同细胞系中进行qRT-PCR和western blotting检测。从图中可以看出，lncROPM在BSCSs中被敲除后，mRNA和 PLA2G16蛋白水平(图4A, C)，而非BSCSs中异位的lncROPM增强了来自临床样本的乳腺癌细胞株和原代乳腺癌细胞中PLA2G16水平(图4B, D)。
2
基因间相关性分析
在临床样本乳腺肿瘤队列中，lncROPM和PLA2G16的表达呈正相关(图4E)。乳腺肿瘤组织中PLA2G16水平升高与TNM分期晚期(p = 0.004)、组织学分级(p = 0.026)、淋巴结转移(p = 0.039)、肿瘤复发(p = 0.005)密切相关(表2)。IHC发现在耐药乳腺肿瘤组织中也观察到PLA2G16水平的升高(图4F-G)。
3
结合位点直接机制验证
图5
lncRNA的作用机制在很大程度上取决于其在细胞内的位置。鉴于lncROPM的细胞质定位，作者假设lncROPM可能在转录后水平影响PLA2G16的表达。qRT-PCR分析检测了lncROPM缺失的BSCSs中PLA2G16 pre-mRNA和成熟mRNA的水平。结果显示，在lncromp敲除的BSCSs中，PLA2G16成熟mRNA (3 ' -UTR、CDS和5 ' -UTR)水平显著降低(图5A-B)。然而，含有三个内含子区域(内含子-1、内含子-2和内含子-3)的PLA2G16 pre-mRNA的水平保持不变，支持lncROPM可能在转录后调控PLA2G16 mRNA的表达。
接下来，通过序列比对分析发现lncROPM可能与PLA2G16 mRNA的3’-UTR相互作用。RNA pulldown用于评估lncROPM和PLA2G16之间的结合能力。发现与对照探针相比，lncROPM探针在沉淀物中明显富集PLA2G16 3 ' -UTR，而不是5 ' -UTR或CDS(图5C)，并将PLA2G16 3 ' -UTR分割为两个片段(图5D)。荧光素酶报告基因检测表明，lncROPM的敲低或过表达显著降低或增强了PMIR-PLA2G16-3 ' -UTR-1的活性，但对PMIR-PLA2G16-3 ‘-UTR -2的活性没有影响(图5E)。然后构建了一组lncROPM片段质粒，发现lncROPM片段(1 ~ 100 nt)足以与PLA2G163 ' -UTR结合，而lncROPM区域(37-52 nt)是与PLA2G163 ' -UTR-1最重要的结合区域(图5G)。并且在lncROPM缺失的BSCSs中，PLA2G16 mRNA的半衰期迅速降低，而在异位lncROPM的非BSCSs中，PLA2G16 mRNA的半衰期明显增加(图5H-I)。由此证实lncROPM与PLA2G16 mRNA的3 ' -UTR结合，增强其mRNA的稳定性。
（三）临床疗效分析
1
生信分析临床疗效
作者利用GEO数据库临床数据分析，发现增强的PLA2G16在乳腺癌组织中对新辅助治疗有部分反应(pPR)，而对新辅助治疗有病理完全反应(pCR)。由此，提示PLA2G16与乳腺癌患者预后不良及化疗耐药密切相关(图4H)。这些数据支持PLA2G16是lncROPM的关键靶点，并有助于乳腺癌的发展和化疗耐药性。由此，可以解释PLA2G16是lncROPM的一个靶点，促进乳腺癌的发展和化疗耐药性。
2
临床疗效验证
图8
由于化疗耐药乳腺癌组织中lncROPM和PLA2G16水平较高(图2K和4G)。为了进一步验证lncROPM和PLA2G16在乳腺癌耐药中的作用，作者研究了lncROPM和PLA2G16在化疗药物作用下对BSCSs生存的影响。结果显示，lncROPM或PLA2G16基因的下调增加了BSCSs对化疗药物(他莫昔芬、阿霉素、顺铂)的敏感性(图8A-B)。然而，在lncROPM-或PLA2G16耗尽的BSCSs或Giripladib处理的BSCSs中添加外源AA可以回复其药物敏感性。
此外，lncROPM或PLA2G16在非BSCSs中的过表达降低了其对化疗药物的敏感性(图8C-D)。接下来，作者检测了lncROPM和PLA2G16在他莫西芬耐药MCF-7细胞、顺铂耐药MDA-MB-231细胞、阿霉素耐药BT549细胞及其亲本细胞的BSCSs中的表达。如预期的那样，在这些耐药的BSCSs中检测到增强的lncROPM和PLA2G16，与亲本BSCSs相比具有较强的干性特性(图8E)，说明lncROPM、PLA2G16和AA赋予了BSCSs。而Giripladib可通过抑制PLA2G16酶活性抑制BCSC耐药。因此，作者尝试使用Giripladib联合临床药物(阿霉素、顺铂或他莫西芬)消除BSCSs。发现Giripladib联合临床药物在减少BSCSs数量方面比单一药物治疗更有效(图8F-G)。
3
体内验证
随后，作者想用裸鼠异种移植模型在体内验证这些发现。与单药组相比，Giripladib联合化疗药物(阿霉素)显著降低了BSCSs的肿瘤发生，抑制了肿瘤生长(图8H, I)。相应的，BCSCs代表性蛋白之一的转录因子KLF4，免疫组化(IHC)染色显示，在接受联合治疗的肿瘤中显著减少(图8J)。综上，这些数据表明lncROPM、PLA2G16和AA有助于BSCSs耐药，而Giripladib协同化疗药物可通过抑制PLA2G16活性有效消除BSCSs。由此，可以说明Giripladib联合化疗药物可有效消除BSCSs。
（四）位点分析
1
PLA2G16对于lncROPM驱动的BCSCs功能性验证
图6
为了了解PLA2G16是否调节BCSC的特性。首先通过qRT-PCR和Western检测PLA2G16在源自乳腺癌细胞和临床肿瘤的BSCSs和非BSCSs中的表达。随后是一上一下的功能验证，以及细胞质磷脂酶A2的抑制剂——Giripladib和PLA2G16酶作用后，发现高效敲除PLA2G16或在BSCSs中使用Giripladib显著降低了干细胞相关基因的表达，并降低了连续代培养时乳腺球形成的效率(图6D, F)。在非BSCSs中过表达PLA2G16促进了干细胞表型(图6E, G)。
这些数据表明PLA2G16有助于BSCSs的干性特征。为了进一步证实PLA2G16在CSCs中的作用，通过流式细胞分选，从乳腺癌细胞中分离出PLA2G16高表达(PLA2G16+/high)和PLA2G16低表达(PLA2G16−/low)细胞。结果与PLA2G16−/低细胞相比，PLA2G16+/高细胞中的CD44+/CD24−/低细胞数量和csc相关基因显著增加，这意味着PLA2G16可能促进干细胞的自我更新和增殖。
综上所述，这些发现表明PLA2G16参与调节CSC的干细胞特性，并可能作为BSCSs干细胞的生物标志物。
2
Rescue验证直接作用机制
回复实验验证异位PLA2G16可以部分挽救干细胞相关基因的表达和串联传代中lncROPM缺失引起的自我更新能力(图6H)，而lncROPM过表达诱导的非BSCSs中增强的CSC表型在PLA2G16沉默或失活后明显逆转(附加文件1:图S10C-S10D和图6I)。这些结果证明了lncROPM通过上调PLA2G16对BSCSs的作用。
3
通路机制验证
图7
由于已有研究证实PLA2G16参与了磷脂代谢过程，为了证明lncROPM是否通过PLA2G16诱导的磷脂代谢改变影响BCSC的特性，以及哪些代谢产物对BCSC的茎干性起关键作用，作者采用UHPLC-QTOFMS系统对lncROPM敲除的BCSC和过表达的非BCSC进行脂质组学研究。
确定了PC和PG这两种PLA2G16代谢基质，在lncROPM沉默的BSCSs中显著增加,而Cer和FFA,两个代表PLA2G16代谢物显著降低 (图7A-B)，这表明Cer和FFA可能是与lncROPM与PLA2G16结合所驱动的BCSC特性相关的关键代谢产物。
为了深入研究代谢物对BCSC特性的影响，作者将重点放在变化最大的FFA上进行进一步研究(图7C-D)。并发现PLA2G16敲低或Giripladib处理的BSCSs，以及PLA2G16过表达的非BSCSs中AA的含量受到PLA2G16的调控(图7E-F)，由此证实AA与PLA2G16密切相关。同时，AA在BSCSs中明显富集，而非BSCSs中含量较非BSCSs高(图7G)。这些证据表明，AA对BSCSs的维持至关重要，并可能作为临床乳腺癌恶性肿瘤的生物标志物。为了进一步验证AA对BSCSs的作用，作者将外源AA应用于BSCSs的性能分析。AA处理可以挽救被抑制的干细胞相关基因(如Sox2、Oct4和Klf4)的表达和sh-lncROPM或shPLA2G16在BSCSs中引起的乳腺巨噬细胞形成效率(图7H)。随后评估了经典的干细胞相关信号通路(如Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、Hippo/YAP、PI3K/AKT)的活性，发现AA可以特别激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号通路。
综上，这些数据证实lncROPMPLA2G16信号轴调节磷脂代谢，导致AA产物增强，从而激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号，促进BSCSs干性。
总结一下研究套路，第一步就是表达差异。范文首次发现lncROPM在BSCSs中高表达并定位于细胞质中。然后是体外实验验证分子机制。在机制上，作者做了直接机制，验证了lncROPM上调PLA2G16的表达，通过稳定PLA2G16 mRNA改变磷脂代谢，同时导致大量的自由脂肪酸，特别是花生四烯酸的产生，从而激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号通路，促进CSCs的功能。
接下来就是临床验证。范文分了两个层面，一是生存预后意义，二是临床证据，发现lncROPM和PLA2G16与肿瘤恶性程度、复发、临床乳腺癌患者化疗耐药与预后不良。结合作者前期已经在慢性骨关节炎患者的临床试验中的发现，测试过的细胞质磷脂酶A2抑制剂Giripladib可以有效抑制BCSC特征和化疗耐药。此外，临床治疗药物如阿霉素、顺铂或他莫昔芬联合Giripladib在体外和体内都明显有利于消除乳腺癌中的CSCs。总之，范文不仅揭示了lncROPM在调节CSCs干细胞的关键作用，也为乳腺癌的治疗提供了一种新的策略。
好了，这篇30分+的TCGA数据库纯生信高分文献就解读到这里了~
后台回复“0107”获取范文一起学习吧，下期再见了，拜拜！
参考文献
[1] Liu S, Sun Y, Hou Y, Yang L, Wan X, Qin Y, Liu Y, Wang R, Zhu P, Teng Y, Liu M. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol. 2021 Oct 29;14(1):178. doi: 10.1186/s13045-021-01194-z. PMID: 34715882; PMCID: PMC8555326.
往期传送门
重磅最新消息！DeepMind首次突破蛋白折叠的历史难题，这项AI技术能否成为生信领域的下一匹黑马？
欢迎大家关注解螺旋生信频道-挑圈联靠公号~
—
END—
撰文丨菠小萝
排版丨四金兄
主编丨小雪球
最新评论
推荐文章
作者最新文章
你可能感兴趣的文章
Copyright Disclaimer: The copyright of contents (including texts, images, videos and audios) posted above belong to the User who shared or the third-party website which the User shared from. If you found your copyright have been infringed, please send a DMCA takedown notice to [email protected]. For more detail of the source, please click on the button "Read Original Post" below. For other communications, please send to [email protected].
版权声明：以上内容为用户推荐收藏至CareerEngine平台，其内容（含文字、图片、视频、音频等）及知识版权均属用户或用户转发自的第三方网站，如涉嫌侵权，请通知[email protected]进行信息删除。如需查看信息来源，请点击“查看原文”。如需洽谈其它事宜，请联系[email protected]。
版权声明：以上内容为用户推荐收藏至CareerEngine平台，其内容（含文字、图片、视频、音频等）及知识版权均属用户或用户转发自的第三方网站，如涉嫌侵权，请通知[email protected]进行信息删除。如需查看信息来源，请点击“查看原文”。如需洽谈其它事宜，请联系[email protected]。