理性设计植物生物酶提高植物的生物量和光合效率，河南农业大学王燃：从实验室走向大田仍需努力

植物育种是改变植物性状以产生所需特征的科学，它已被用于改善人类和动物产品的营养质量，目标是培育出适用于各种农业应用的具有独特和优越性状的作物品种，植物育种的关键就在于寻找优良基因。

选择优良基因可以从现有品种、群体和一些野生品系中寻找决定目标性状的重要基因及其变异，但植物自然进化几百万年也很难产生理想的突变，因此通过现有的基因工程技术设计改造出原来自然界不存在的、能产生预期性状的超强蛋白质是一条可以期待的路线。

近日，河南农业大学王燃团队和河南大学棉花生物学国家重点实验室苗雨晨团队合作，对烟草萜类物质合成的关键生物酶开展理性设计，构建了一整套基于蛋白结构的生物酶理性设计（理性设计：借助计算机和目前积累的对蛋白结构的认识去尝试设计改造蛋白质）的技术体系，填补了植物生物酶理性设计工程的研究空白，相关成果以 “Rational Design of Geranylgeranyl Diphosphate Synthase Enhances Carotenoid Production and Improves Photosynthetic Efficiency in Nicotiana tabacum” 为题，发表在 Science Bulletin 上。

（来源：Science Bulletin）

为此，生辉 SynBio 邀请到了王燃博士与我们分享他的研究成果。

2001 年 9 月，王燃在河南大学生物生命科学学院开启本科阶段的学习，专业为生命科学，2005 年 9 月进入中国科学院遗传与发育生物学研究所进行硕博连读并获得博士学位，先在郑州烟草研究院开展植物基因功能研究工作，现就职于河南农业大学生命科学学院，主要研究方向为植物分子生物学和基因功能。

图丨王燃（来源：受访者提供）

理性设计植物生物酶

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPPS）是植物萜类物质合成的关键蛋白酶，其酶活性决定各个分支萜类物质的含量。

萜类化合物是植物体内数量和结构变化最多的一类代谢物，包括单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜等各种类型，广泛参与植物生长发育、光合作用、信号转导、环境适应及抗逆等各种生理过程，发挥着重要的生物学功能。

异戊烯基焦磷酸（IPP）和烯丙基异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）是萜类化合物生物合成的重要前体，IPP 和 DMAPP 可以在异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）的作用下相互转化。IPP/DMAPP 可以通过两个途径合成，即位于细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径和位于植物质体中的甲基赤藓醇 - 4 - 磷酸（MEP）途径。

图 | 植物体内萜类合成途径（来源：研究论文）

NtGGPPS 是模式植物烟草中 MEP 途径中的一种关键酶，NtGGPPS1 是 NtGGPPS 最重要的家族成员，纯合 NtGGPPS1 突变体叶面积及株高显著降低，八氢番茄红素、β- 胡萝卜素、叶黄素、新黄质、紫黄质和花药黄质均显著减少。

王燃及其团队将烟草中含有的 NtGGPPS1 酶与底物进行对接，确定酶的活性口袋周围的 16 个氨基酸位点（图 a），构建单点饱和突变体库。通过高通量的细菌颜色实验进行筛选，获得 5 个可以显著提升酶活性的氨基酸位点，并进一步对以上位点进行迭代组合突变获得酶活性最高的突变体 d-NtGGPPS1（V154A/I161L/F218Y/I209S/V233E）（图 b）。

图丨a. NtGGPPS1 的酶的活性口袋；b. 理性设计的 d-NtGGPPS1 氨基酸位点；c. 转基因 d-NtGGPPS1 烟草的表型，色素及光合作用效率

相对于 NtGGPPS1，理性设计的 d-NtGGPPS1 可以将底物 IPP 和共同底物 DMAPP 转化为 GGPP 的效率提高约 1995.5 倍，将 GPP 转化产生 GGPP 的效率提高约 25.9 或 16.7 倍。

将理性设计后的 d-NtGGPPS1 回补到 NtGGPPS1突变体可以显著提高烟草的叶面积、株高及生物量，显著提升烟草叶片类胡萝卜素（八氢番茄红素、β- 胡萝卜素、叶黄素、新黄质、紫黄质和玉米黄质）及叶绿素（叶绿素 a 和叶绿素 b）含量，增强烟草的光合作用效率及抵抗强光逆境胁迫的能力（图 c）。

该研究表明理性设计 GGPPS 可以提升植物的产量和品质性状，为未来通过理性设计获得植物优良基因提供新的突破口。

王燃说，“通过理性设计实现植物的基因改造目前国内较少，而且改造相对较难。”

他补充道，关键难点是建立快速筛选的酶活体系，很多酶的底物目前只能靠仪器检测比如质谱，肉眼无法观测到；其次，通过计算机模拟预测酶活中心最关键的氨基酸，氨基酸的空间位置任意变化都会改变酶的活性；最后，之前理性设计都是在微生物中验证，这是第一次在植物中进行探索，蛋白质能否在植物体内预期表达仍是未知。

“完全的理性设计目前还很难实现，于是就产生了结合基因文库和筛选技术的半理性设计技术，严格来说，我们目前所做的研究是半理性设计，属于理性设计的范畴。”

植物合成生物学或为育种带来突破

得益于近年来系统生物学和分子生物学等多方面技术的发展，合成生物学的研究对象正逐步过渡到更为复杂的多细胞体系，植物合成生物学正成为合成生物学的 “下一篇章”。

植物拥有丰富的内膜系统和细胞器、高度特化的生物合成基因簇、精细的代谢调控网络，为开展相关研究提供了理想的模式体系。

以植物为底盘的合成生物学研究，如设计检测环境变化的植物传感器、开发精准修饰的基因编辑技术、建立高效异源合成代谢途径和生物反应器底盘等，不仅有助于人类加深对复杂生命运行规律的理解，还有望为解决农业生产、生物制药、能源环境等方面的困境与难题提供新策略，实现可持续发展。

目前最常见的底盘植物是拟南芥，拟南芥由于其植株小、结实多、生命周期短、基因组简单、遗传操作简便，近四十年来由田野里不起眼的小草成为植物研究领域最耀眼的明星。

图 | 微笑的拟南芥（来源：中国科学院遗传与发育生物学研究所）

“烟草是一个非常好的底盘植物，容易转化和栽培，并且烟草也是中国非常重要的经济作物。”

图丨烟草（来源：云南省烟草农业科学研究院）

王燃表示，植物基因组研究的首要难点在于周期长，譬如小麦，每年十月开始种植，第二年六月收割，就连生长周期较短的拟南芥也最少需要三个月左右的时间；其次对于作物的基因功能整体认识不够，改造一个基因很难实现预期性状；另外，植物譬如小麦等等作物基因组较大，基因克隆和定位的过程难度比较大。

他补充道，虽然研究植物基因组较难，但选择植物是必须的，否则不能开展育种和技术的有效转化应用，植物是不会说话、不会表达情绪的，必须通过各种性状的检测才能判断基因是否发挥了功能。

植物合成生物学是一个结合了工程学原理与植物生物学原理以取得设计和产品方面新计划的新兴领域，这个新兴领域可以在未来农业中改进传统作物的方向上起到重要作用，也使得培育新奇的植物生物产品的实现成为可能。

从实验室走向大田仍需努力

“做植物研究的最终目标是落地，从实验室到大田需要群体和中间技术去实现，譬如理性设计，设计的基因如果不能开展基因转化也是不能产生品种的，需要结合其他群体和技术开展品种创制工作，在推入大田前，需在实验室严格控制作物的生理指标，大田推广程序较严格，从小规模种植到大规模区试再到推广，必须经历非常严格的周期，” 王燃告诉生辉 SynBio。

他补充道，“要想从实验室推广到大田，研究基础必须要牢固，快速并准确的确定靶标及基因功能应用方式，并结合大田生产采用合理的推广路径。”

由于大田环境条件多变，目前报道的很多实验数据来源于实验室或温室，缺乏田间数据，因此需加大对田间高通量表型监测平台的建设力度。

自然环境的大田中盐碱、干旱区域分布极不均匀，不断变化的自然条件加上灌溉不当不仅导致大量淡水资源的浪费也使得农业土壤出现一定程度上的退化，导致盐碱、干旱区域不断增加；目前虽然对每种胁迫单独存在时如何影响植物的生长发育了解相对较多，但对植物如何协调并适应不同胁迫组合却知之甚少。