新一轮生物技术革命将如何颠覆未来？这些雄心勃勃的合成生物学家最了解答案。
本期「合英才 生万物」人物系列专访嘉宾，是来自中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所（以下简称 “合成所”）的施小山研究员。
研究蛋白质复合物就像在拼积木，两者均由多个组件（蛋白亚基）拼接而成，随时可以越拼越大，并且每一个组件都十分重要。
从冷冻电镜到 AlphaFold2，科学家一直在致力于展示蛋白质的真实结构，了解结构能够帮助更好地分析预测蛋白功能。然而，通常蛋白质像人一样是动态变化的，并且有多种多样的修饰变化及多种多样的“合作伙伴”，从而可以实现多种多样的功能。至今，要想同时捕捉这些多样的状态并不容易。
来自中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所（以下简称 “合成所”）的施小山研究员，经过多年的研究，开发了基于质谱的蛋白质研究方法，能够同时捕捉蛋白多样的状态。
图丨施小山（来源：受访者）
施小山 2009 年毕业于上海交通大学，2015 年获得中科院上海生化细胞所生物化学与分子生物学博士学位，2016 年赴美国加州大学伯克利分校做博士后。今年 6 月来到合成所，创立实验室运用新型质谱技术研究 T 细胞肿瘤免疫中关键蛋白复合物并开展肿瘤免疫治疗相关研究。
施小山博士期间主要研究 T 细胞抗原受体的信号转导机制，博士后期间主要研究 ULK1 复合物起始调控自噬过程的分子结构机制。
“我在博士期间主要研究了两个问题，一是在识别抗原后，T 细胞抗原受体的活化信号放大过程是如何发生的？二是在不同抗原刺激下，T 细胞抗原受体如何产生不同的磷酸化修饰（蛋白质修饰的一种）来传递相应的活化信号？”
蛋白质修饰：
指蛋白质结构中某一氨基酸位点共价结合了某些化学基团，产生了结构上的变化，导致其功能也会发生变化。同一种蛋白质通常具有多个修饰位点或类型（如磷酸化、乙酰化、泛素化等等），这些修饰在细胞信号传导过程中是动态变化的。目前的蛋白绝对定量分析技术还难以同时分析蛋白复合物的多个修饰位点的变化。
更精准的蛋白质谱绝对定量技术
工欲善其事，必先利其器。
去年，中科院上海生化与细胞所许琛琦团队、北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队、美国加州大学圣地亚哥分校惠恩夫团队联手在 Cell 发表了一篇重要研究成果。施小山作为共同第一作者，参与了这项研究。
这项研究的突破之处在于，通过开发基于质谱的蛋白质磷酸化修饰绝对定量方法，可以在一次测量中对不同时间点 T 细胞抗原受体内全部 6 个 ITAM（免疫受体酪氨酸激活模体）的总共 12 个磷酸化修饰进行绝对定量，描绘 T 细胞抗原受体 - 共受体（TCR-CD3）复合物的酪氨酸动态磷酸化修饰全貌，并且实现低成本、高效、高定量准确性。
（来源：Cell）
这种绝对定量方法被称为 Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass Spectrometry（TIMLAQ-MS），是一种质谱和免疫沉淀联用的技术（如下图）。
“我们在样品的处理和质谱流程的设计上开发了一套专有的方法，使得蛋白绝对定量更高效准确。这一方法通用性很强，使用时只需根据目的蛋白的不同进行调整。” 施小山介绍到。
该方法无需常规绝对定量方法使用的同位素重标记肽，减少了实验操作步骤，既节约了成本也提高了定量准确性，可在一次测量中对不同时间点所有的磷酸化修饰进行绝对定量。
图丨 TIMLAQ-MS（来源：研究论文）
“在这项研究中，我们绝对定量分析了 T 细胞抗原受体中全部 6 个 ITAM 的全部 12 个磷酸化位点，并找到了关键 ITAM，指导后续 CAR-T 细胞的设计。”
具体来说，该团队对每一种 CD3 亚基的修饰变化进行绝对定量分析，发现仅有 CD3ε 的 ITAM 具有明显持续的单磷酸化模式。后续将 CD3ε 结构域整合到第二代 CAR 中，可以减少 CAR-T 细胞因子的产生并增加 CAR-T 细胞的持久性，从而减弱细胞因子风暴副作用并提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性。这一研究也因此入选中国科协生命科学学会联合体评选的 “2020 年度中国生命科学十大进展” 及中国医学科学院评选的 “中国 2020 年度重要医学进展”。
“也是因为构建了这个方法，我去到了加州大学伯克利分校做博士后，继续在质谱分析技术上进行研究。”
关注自噬和肿瘤免疫
施小山在博士后期间主要运用氢氘交换质谱技术研究 ULK1 复合物起始调控自噬过程的分子结构机制。
自噬是细胞内清除异物的自我保护机制，许多情况都会触发细胞的自噬过程，但自噬参与复合物之间的组装并不是固定的，而是会根据具体情况和货物受体的不同，选择性地组装并起始特定自噬程序。
同样地，施小山先通过质谱的方法解析了自噬起始 ULK1 复合物各亚基的组装机制，后续通过对其与其余自噬参与复合物的相互作用研究，确定了在不同货物受体介导下，自噬参与复合物之间的组装过程和主要发挥作用的结构域。
图丨不同受体介导的自噬机制（来源：研究论文）
施小山告诉生辉 SynBio，其使用的定量质谱技术是一种偏基础的技术，针对目标蛋白往往需要特异性地修改实验方法，因此很难将实验方法进行产业化。基于此前对于各类机制的深入研究，在加入合成所之后，希望展开一些能够进行产业转化的研究，他将目光锁定在肿瘤免疫方向：一是通过质谱的方法找到 T 细胞抗原复合物内合适的抗肿瘤靶点，二是探究自噬过程在 T 细胞杀伤肿瘤中的具体作用以指导后续靶向治疗方案开发。
“近些年来，各界都认识到肿瘤免疫的重要性，因此该领域发展的速度很快。每个人都有各自的方法，我认为我们的质谱技术能提供更快、更有效的解决思路。”
当前肿瘤治疗的一个难题是肿瘤组织的异质性，由于其高度的变异性，肿瘤细胞的基因和表型都不同。常规疗法若无法完全杀死所有肿瘤细胞，就会导致存活的肿瘤细胞继续生长和变异。
“肿瘤细胞有异质性，而 T 细胞也有异质性，两者正好可以对抗。”
这里的 T 细胞是指宿主自身的免疫系统，通过靶向免疫细胞上的关键蛋白的药物或抗体，调整免疫细胞的状态，促进针对不同肿瘤细胞的 T 细胞进行肿瘤杀伤。以 T 细胞抗原受体为例，了解其发挥功能的机制后，就可以通过操控蛋白进而控制 T 细胞的行为，增强或减弱免疫反应。
施小山也表示他的质谱方法是公开的，希望能有更多学者将其应用到他们各自的研究中，扩展到更多的领域。
施小山老师认为致力于科研是丰富科学，同时还要多读书来认识自己。以下是施小山老师推荐的书单：《三体》《瓦尔登湖》《苏菲的世界》《枢纽》《枪炮病菌与钢铁》《临高启明》及“四大名著”等。
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