CNS的宠儿！这个组学一亮相就 发了Cell！又一波新的红利，抓紧来学！
单细胞组学结合空间组学（三）
大家好，我是风风。今天我们继续“单细胞组学技术结合空间组学技术高分文献”系列。在本系列的推文中，我们已经完成了一篇《Cell》和一篇《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》，按照一篇主菜一篇凉菜的原则，今天我们又是到了主菜环节——来自《Cell》的“High-Spatial-Resolution Multi-Omics Sequencing via Deterministic Barcoding in Tissue”闪亮登场，并带来了一种新的空间组学技术——DBiT seq技术。
此时此刻我竟然有个小小的野心，不如就在本系列集齐CNS召唤神龙吧？加上今天这篇文章，已经给大家推了两篇《Cell》，还差《Nature》和《Science》，《Nature》的文章好找，《Sicence》上面的空间生物学文章我得去好好挖一挖。好了，同样给大家奉上《Cell》的最新信息：
High-Spatial-Resolution Multi-Omics Sequencing via Deterministic Barcoding in Tissue，翻译过来就是“基于组织内确定性条码的高空间分辨率多OMICS测序”。看起来像是在介绍一种新的技术，我们再看看In Brief：DBiT-seq is a microfluidic-based method to deliver barcodes to the surface of a tissue slide to allow for spatial omics sequencing with 10-um pixel size.
这下明白了，这文章真的是讲一种新的空间组学测序技术，基于微流控的DBiT-seq技术，这种技术可以将条形码传送到组织切片表面，以实现10 um像素大小的空间组学测序。
为了让大家带着一定的背景知识进入文章，我把文章的Figure1提前到这里先一起看看：
Figure1: Design and Validation of DBiT-Seq.
这里简单说一下DBiT seq的原理，详细的内容还请大家直接看原文Figure Legend的描述：
在芯片中心具有50个平行微通道的定制设计的PDMS（聚二甲基硅氧烷）微流控芯片对准后放置在组织载玻片上，以引入第一组表面引入带有oligo-dT的DNA条形码A1-A50。
每个条形码与连接接头和用于结合mRNAs或ADT的PolyA尾巴的寡核苷酸序列相连。然后，进行逆转录(RT)以产生共价连接到条形码A1-A50的cDNA。接着取出这个微流控芯片，并将第二种微流控芯片垂直放在组织载玻片上，以引入第二组标记蛋白的DNA条形码B1-B50。通过连接将条形码A和B连接在一起，然后第一和第二PDMS芯片中的微流体通道的交叉区定义具有唯一组合A和B的不同像素，从而产生空间条形码AIBJ(i=1-50，j=1-50)的二维阵列（也就是A1-A50和B1-B50交叉原位连接产生AiBj）。这时候第二个PDMS芯片就可以被移除，同时对所有mRNA和感兴趣的蛋白质进行空间条形化。条形码组织在光学或荧光显微镜下成像，以可视化单个像素。
后面就是大家比较熟悉的内容了：提取cDNA-PCR扩增-制备文库-成对末端测序，结合前面标记的条形码信息（使用UMIS将空间条形码AIBJ与相应的cDNA读取进行匹配），进而绘制高分辨率多组学空间图谱。
从原理我们就可以看出来，这种做法和我们前面两期推文文章用的Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiling（DSP）和MultiOmyx™是两种不同的做法。其实并不奇怪啊，虽然都是空间生物学，大家实现的手段也不一样，但是提供的信息是有共通之处的，就是提供基因表达的空间信息，从而解决空间异质性的问题。
空间信息可能和大家想的不太一样，不是三维的那种空间哈，就像我们上面说的DBiT，把微流控芯片放在组织载玻片上，那不就是一个平面吗？提供的不就是二维平面的空间信息吗？再回想我们本系列第一次推文说的DSP技术，在病理图片上画ROI区域，病理图片提供的不也是二维平面的空间信息吗？所以空间信息其实还是在二维上的空间，联想一下我们小学学数学画图的时候，是不是两点之间成一直线，很多线条就构成了平面呢？我们把每个基因的表达看成点，每两个点成一直线，很多个点构成很多直线进而变成平面，不就拥有了空间信息了。那为什么还有那么多种空间生物学技术呢？我们对比一下，不管是DBiT还是DSP，其实都强调了“分辨率”的问题，没错啊，这个“分辨率”咱们就按照手机拍照功能的“分辨率”理解就行，分辨率越高，得到的空间信息就越准确咯！分辨率只是空间生物学的其中一个难题，以前看过一篇综述列举了空间生物学的好几个难题，等我去翻翻，翻到了我们拿出来说。
这篇文章的主体内容是利用DBiT技术绘制了小鼠的胚胎空间多组学图谱，分析了小鼠胚胎早中期器官发育的主要组织类型，并展示了小鼠胚胎发育中全转录组和22个蛋白质的空间高分辨率图谱，也就是一个profile的研究，原文我放在了后台，回复关键词即可获取，接下来简单看下文章结果：
小鼠全胚胎空间多基因组定位研究
Figure 2. Spatial Multi-Omics Mapping of Whole Mouse Embryos
接下来，作者使用DBiT-seq解析了小鼠胚胎发育空间多组学图谱。
Figure2A: 从DBiT-seq重建的Pan-mRNA和Pan-蛋白质面板空间表达图(像素大小，50 um)，左图是HE染色的图片，右图为UMI计数空间图(mRNA+蛋白)；
Figure2B: 与bulk-seq比较的UMAP图。与bulk-seq数据进行比较。DBiT-seq分析的4个胚胎样本(E10)与单细胞RNA-seq分析的胚胎样本在发育阶段上的关系正确地一一对应；
Figure2C-2E: 基于GO富集分析，空间像素转录本的非监督聚类揭示了11个主要聚类簇，这些簇与端脑(前脑)、中脑(中脑)、菱形脑(后脑)、鳃弓、脊髓神经管、心脏、四肢以及主体的腹侧和背侧的早期内脏发育相关。利用文献数据库和经典的Kaufman’s Atlas小鼠发育图集，进行了手动注释，揭示了13种主要组织类型；
Figure2F: 比对8对mRNA/蛋白质对在13个带解剖学注释的组织区域中的表达情况，作为泛上皮标记物，EpCAM的表达定位于mRNA和蛋白质的高度特异性区域。ITGA4在心外膜发育过程中起重要作用，在心脏和其他组织中均有高表达，在脑区中观察到泛白细胞蛋白标志物CD45，但其同源mRNA Ptprc的表达水平较低。
小鼠胚胎脑地空间多组学图谱
Figure 3. Spatial Multi-Omics Mapping of an Embryonic Mouse Brain
Figure3是作者使用DBiT-seq分析了其中一只小鼠的胚胎的大脑区域（25um）。
Figure3A: 小鼠胚胎大脑区域的亮场图像(E10) ；
Figure3B-3D: 与50 um的实验(Figure2)相比，Pan-mRNA和Pan-蛋白质UMI计数图显示了与组织形态学相关的更精细的结构。通过分析22个蛋白质，观察到至少12个蛋白质的不同表达模式，其中4个如图3D所示。除部分前脑组织外，CD63广泛表达。PECA是一种泛内皮细胞标志物，在脑微血管系统中被明确检测到，在组织中不易被区分；
Figure3E-3G: 为了验证上面的观察结果，作者使用来自同一胚胎的邻近组织切片进行免疫荧光染色，以检测EpCAM和PECA。将DBiT-seq和免疫荧光染色获得的空间表达图叠加到HE图像上，绘制它们的线条轮廓以进行定量比较。不同的组织切片用于DBiT-Seq和免疫荧光，尽管在确切的peak位置上观察到一些不一致，但主峰之间彼此一致。最后，作者使用所有mRNA表达谱进行了无监督聚类，并确定了10个不同的聚类。然后，对照HE图像绘制了四个具有代表性的集群中像素的空间分布。对标记基因的通路分析表明，簇1主要参与端脑发育，簇2与血管中的红细胞相关，簇3与轴突发生有关，簇4与心肌发育相对应，与解剖学解释一致。簇2富含红细胞中的血红蛋白基因，与描绘内皮微血管的PECA蛋白表达一致。这进一步证明，高质量的空间蛋白质定位数据可以用来指导全基因组的空间基因表达分析。
早期眼球发育的高空间分辨率图谱
Figure 4. Spatial Gene Expression Mapping of Early Eye Development.
Figure4A-4C: 作者使用10 um的微流控芯片对E10小鼠胚胎发育中的眼球进行了进一步的空间转录组映射，并将得到的Pan-mRNA UMI热图 (红色)叠加到整个小鼠胚胎组织图像上。局部放大视图显示了印记的形态。对相邻组织切片进行HE染色。在这个阶段(E10)，眼睛的发育可能达到视泡的晚期。并在视泡中发现了四个基因，它们有不同的表达模式，但在空间上息息相关。
Figure4D-4G: 作者在E11小鼠胚胎上进行了10 um DBiT-seq，并将其与E10的眼野区域进行了比较。Pmel、Pax6和Six6在E10和E11胚胎眼周围的表达模式相似，但随着E11视杯的开始形成，Pmel、Pax6和Six6的表达呈现空间变化。此外，作者还分析了其他已知与早期眼睛形成有关的基因。Aldh1a1是一个编码乙醛脱氢酶1家族成员A1的基因，主要位于视网膜背侧，而Aldh1a3主要位于视网膜腹侧和视网膜色素上皮。Aldh1a1和Aldh1a3在眼野内的空间分布以及从E10到E11的变化与文献一致，表明Aldh1a家族基因在胚胎眼发育过程中对背腹偏振有不同的控制作用。我们注意到Msx1基因在睫状肌和睫状体上皮细胞中高度表达，是眼的结构支撑物，它主要分布在E10和E11胚胎的眼球周围。Gata3基因是闭眼的关键基因，在发育过程中控制眼睛的形状。
接下来，作者将空间组学数据与单细胞RNA-Seq数据进行直接整合
Figure4H-4K：作者根据19个排名靠前的基因的空间表达模式观察到了额外的组织特征，但是细胞类型不容易识别。由于实验中像素大小接近细胞水平，因此，作者推测直接整合来自scRNA-seq和DBiT-seq的数据来推断细胞类型并进行空间分布可视化。来自E9.5和E10.5小鼠胚胎的scRNA-seq数据被用来联合DBiT数据执行非监督聚类。结果发现，空间像素(红色)很好地符合单细胞转录本(蓝色和灰色)，并共同识别了组合数据集中的24个簇。每个簇被映射回其在组织中的空间分布(图4J中示出了8个簇)。进一步使用scRNA-seq数据作为细胞类型注释的参考，并将报告的53种细胞类型直接与UMAP中的DBiT-seq数据(黑色)进行比较，从而允许检测每个像素(10 um)中的主要细胞类型。
Figure4L-4N：作者将scRNA序列注释的细胞类型链接到相应的空间像素，并可视化组织上的细胞类型分布。首先，检查了第2、8和22簇中的空间像素，发现主要的细胞类型是视网膜轨迹、视网膜上皮和少突胶质细胞。将细胞类型注释的像素映射到组织图像显示，视网膜轨迹和视网膜上皮细胞确实定位在视泡内，而少突胶质细胞定位于三个组织区域，其中一个对应于视柄，紧挨着视泡，这与观察到的多个少突胶质细胞像素亚群的存在是一致的。图4H b中的空间像素仅分布在14和16簇中，发现这些簇主要由红系和内皮细胞组成。作者还分析了图4H的c-f中的空间像素以及相应的群集0、4、19和20。通过将空间像素与细胞类型联系起来，发现了以下几种类型的细胞：结缔组织(C)作为眼睛形成的结构支撑，上皮细胞(D)构成垂体，肌肉细胞(E)包围三叉神经感觉神经用于面部触摸感知，以及三叉神经节神经元(F)位于三叉神经感受器本身。因此，具有10 um像素大小的DBiT-seq可以直接与scRNA-seq整合，以推断细胞类型并可视化组织环境中的空间分布。
对不同时期(E10-E12)胚胎样本的聚类分析
Figure 5. Global Clustering Analysis of 11 Mouse Embryos from E10, E11, and E12
为了进一步了解小鼠胚胎随时间的早期发育，作者整合了来自E10，E11和E12三个阶段的11个小鼠胚胎组织样本的DBiT-seq数据并进行了无监督聚类，其中显示了通过t-SNE可视化的20个聚类和差异表达的基因。簇2与肌肉系统过程相关，其中Myl基因家族优先表达，并且该簇主要来自三个E11样品。尽管来自同一样本的像素在没有批量归一化的情况下聚类在一起，但是一些样本（E11 Tail (25 um) 1）显示出多个远处聚类，表明该样本中组织的显着差异。大像素（50um）倾向于远离UMAP的起源，可能是因为它们覆盖了更多的细胞并且在一个像素内具有更高程度的细胞多样性。相反，10um像素聚集在UMAP的中心周围，表明单细胞水平的基因表达。E10，E11和E12像素沿着相同的轨迹（从左到右）与开发阶段一致，尽管这些样本差异很大，因此它们被映射到不同的组织区域和不同的像素大小。
内脏器官发育的空间定位
Figure 6. Mapping Internal Organs in a E11 Mouse Embryo.
为了知道哪些细胞类型构成Figure5中的不同簇，作者将四个子集群（a，b，c和d）映射回组织图像，揭示了它们的空间模式。该样本中所有像素的聚类分析确定了在UMAP和空间图中可视化的13个聚类。为了揭示这些空间模式的身份，作者再次使用scRNA-seq作为参考，用SingleR执行自动细胞类型注释。这些空间簇（a，b，c和d）中的主要细胞类型与不同的内部器官如肝脏（簇a），中性管（簇b），心脏（簇c）和含有凝血的血管红细胞（簇d）。最后G图再进一步可视化了8个代表性标记基因的空间表达。
基于空间差异表达的自动特征识别
Figure 7. SpatialDE for Automated Feature Identification.
使用SpatialDE (空间差异表达)对DBiT-seq数据进行分析，以自动发现空间组织特征。除了Figure 4中与眼睛发育相关的主要途径外，SpatialDE还识别了20个其他特征，包括眼睛、耳朵、肌肉、前脑和上皮，这些特征与基于scRNA-seq的细胞类型鉴定结果一致。相反，一些特征在相应的组织图像中很难被区分开来，如耳朵(可能是由于发育过程的早期)和前脑(仅覆盖在绘制的组织区域中)。将SpatialDE应用于Figure 6中的数据，不仅检测到如前所述的心脏、肝脏、背主动脉和神经管，而且还检测到被绘制的组织区域覆盖的一小部分肺芽。许多内脏器官在E10阶段开始发育，但几乎无法区分。为了进一步评估SpatialDE检测更多不同器官或组织的潜力，作者使用DBiT-seq对E12小鼠胚胎进行了分析。仅在整个胚胎组织切片的三分之一，SpatialDE就确定了40个不同的特征，包括心、肺、泌尿生殖系统、消化系统和男性性腺。总之，利用SpatialDE可以对DBiT-seq进行精确的特征识别。
综上所述，本文报道了一种通用的技术，基于微流控的DBiT-seq技术，其用于在固定的组织载玻片上和细胞水平测量mRNA转录组和22个蛋白质。DBiT-seq与其他基于NGS的空间转录方法有根本的不同，只需要一套试剂和一个简单的设备就可以进行实验。该工作流程可以绘制其他生物分子信息的图谱。它可以在生物和生物医学研究的广泛领域找到应用，包括发育生物学、神经科学、癌症、免疫生物学和临床病理学。
好了，今天的内容到此结束，后台回复“feng68”获取全文，我们回见(*^_^*)！
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END—
撰文丨风 风
排版丨四金兄
主编丨小雪球
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