真香预警！近30分多组学干湿结合套路，你看这些图是不是很熟悉，仿佛自己也能来一套的样子？！
解读生信之美，探索高分文章背后的生信逻辑
大家好呀，我是风间琉璃。上一周我们讲了ATAC-seq+ChIP-seq在高分文章的应用，这一周我们继续探索如何利用ChIP-seq+细胞谱系示踪（lineage tracing）+scRNA-seq同样发表领域顶刊的吧。文章“Stem Cell Pluripotency Genes Klf4 and Oct4 Regulate Complex SMC Phenotypic Changes Critical in Late-Stage Atherosclerotic Lesion Pathogenesis” 于2020年发表在《Circulation》杂志。2021年影响因子29.69分。我们一起来看看吧~
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作者采集人高级别颈动脉粥样斑块、对应的小鼠的高级别动脉粥样斑块以及平滑肌细胞和内皮细胞的细胞谱系示踪技术（lineage tracing）来阐明斑块中的各种细胞类型。并进一步通过ChIP-seq以及bulk RNA-seq以及双重细胞谱系示踪技术民古切尔平滑肌细胞表型转换对斑块疾病进展。作者发现平滑肌细胞特异性敲除Klf4和Oct4具有几乎完全相反的基因组特征，而他们的靶基因在调控平滑肌细胞表型转变中具有重要作用。单细胞测序结果提示小鼠和人类动脉粥样斑块具有明显的相似性，并且内皮细胞和平滑肌细胞具有7种完全不同的分群。值得注意的是，Myh11 -Lgals3 + 平滑肌细胞群具有软骨细胞样特征，并在平滑肌细胞特异性Klf4敲除之后显着减少。作者观察发现Lgals3 +的细胞占据所有平滑肌细胞总量的2/3，但是初始激活Lgals3并不能代表细胞已经最终分化的细胞状态，而是一种独特的干细胞标志物阳性、细胞外基质重构的细胞过渡状态，并在高级别动脉粥样斑块转变为至少3种其他的平滑肌细胞表型，比如Klf4依赖的成骨样平滑肌细胞表型，其可能导致斑块钙化和斑块不稳定。
首先作者为明确在平滑肌细胞中Klf4和Oct4敲除后的基因表达变化，作者对Klf4/Oct4敲除组和对应的对照组进行ChIP-seq和bulk RNA-seq。作者发现差异分析后在Klf4敲除组vs.对照组上调基因所富集的通路与Oct4敲除组vs.对照组下调调基因所富集的通路相重叠（Figure 1A-D）。接下来作者将明确在Klf4敲除组vs.对照组或者Oct4敲除组vs.对照组ChIP-seq分析具有明确差异基因与GWAS相关联，发现其中有88个基因位于已知和心血管风险相关的位点上（Figure 1E-F）
值得学习的是，作者把细胞谱系示踪和单细胞测序结合进行分析。由于血管平滑肌细胞特异性表达Myh11、内皮细胞特异性表达Cdh5，因此作者将高级别Myh11-CreERT2 Rosa-eYFP小鼠以及Cdh5-CreERT2 Rosa-eYFP小鼠进行scRNA-seq分析，这样被标记的血管平滑肌细胞和内皮细胞就会转录表达eYFP蛋白从而方便鉴定。并为了增加对照，作者还添加健康动脉样本进行scRNA-seq分析。根据经典的细胞marker，作者一共将14个细胞群分为四种不同的细胞类型：巨噬细胞、T细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞（Figure 2A-D）。根据Myh11谱系示踪的细胞，作者发现平滑肌细胞是其中7个细胞群的主要来源，而内皮细胞则是第8群细胞的主要来源（Figure 2F-G）。但根据Myh11的表达情况，7个细胞群并不完全表达Myh11以及其他的传统血管平滑肌细胞marker。而是表达aVcam1、Dcn、Lgals3等与细胞外基质重构与钙化相关的基因（Figure 2E）。
为了进一步明确平滑肌细胞条件翘楚Klf4导致斑块大小明显减少的原因，作者对Klf4敲除组和对照组小鼠的高级别动脉粥样硬化斑块进行scRNA-seq分析。作者发现在表达传统平滑肌细胞marker的第1、2群中，来自于Klf4敲除组细胞数是对照组的两倍，除此之外Klf4敲除组中，Lgals3 +成骨样表型的平滑肌细胞数较对照组明显减少（Figure 3A-C）。与此同时，作者进一步在组织学层面进行验证，通过免疫荧光染色，作者发现表达传统平滑肌细胞marker的平滑肌细胞（eYFP + Acta2 + Phactr1 +细胞）在Klf4敲除组中明显增加（Figure 3F-G），而表达出特殊表型的平滑肌细胞（eYFP + Trpv4 + S100b +细胞）在Klf4敲除组中明显减少（Figure 3D-E）。提示Klf4在平滑肌细胞的表型转换中具有重要作用。
五、Lgals3+细胞为血管平滑肌细胞主要成分并标志潜在分化过程
作者为了准确的定义Lgals3+的血管平滑肌细胞的潜在特点与表型，通过双同源重组技术（Dual-recombinase-activated lineage tracing，DeaLT）精确的鉴定出表达Lgals3+的血管平滑肌细胞。这里我们需要简单的介绍一下双同源重组技术，常规来说我们通过Cre-loxP 同源重组系统的遗传谱系示踪技术对动物体内某一特定组织表达的基因进行敲除或者示踪，再次基础上引入Dre-rox 同源重组系统，有效地规避了由于Cre表达的不特异性而导致的非特异性同源重组。简单来说就是给我们的特异性示踪技术加上双重保险。在这篇文章中，通过DeaLT技术表达eGFP的细胞就是表达过Lgals3的血管平滑肌细胞，而表达tdTomato的细胞则是表达Myh11血管平滑肌细胞（Figure 4A-B）。在高级别动脉粥样硬化斑块中，通过流式细胞分析以及高分辨率共聚焦显微镜分析eGFP+细胞占总的血管平滑肌细胞总数的60-80%（Figure 4C-D）。而持续Lgals3+细胞值占总量的30%。
另一方面，为了进一步验证平滑肌细胞Lgals3表达后会转换为其他表型，作者对双同源重组细胞谱系示踪的平滑肌细胞进行单细胞测序（Figure 5A）。作者发现tdTomato阳性的细胞主要表达多种收缩型平滑肌细胞marker，而eGFP阳性的细胞则表达Lgals3、炎性基因（Ccl2, Vcam1）、细胞外基质相关基因（Dcn, Lum, Mmp3）等等（Figure 5C）。通过免疫荧光共聚焦同样提示表达平滑肌细胞传统marker-Atac2的细胞主要为tdTomato阳性的细胞，而表达软骨生成相关marker-Sox9的细胞主要为eGFP阳性的细胞（Figure 5D-E）。
六、Lgals3+的血管平滑肌细胞对动脉粥样硬化具有重要作用
由于作者在对高级别动脉粥样硬化斑块双同源重组细胞谱系示踪的平滑肌细胞进行流式细胞分析发现以及共聚焦显微成像提示大概有2%平滑肌细胞同时表达tdTomato和eGFP（Figure 4D-E）。而eGFP的半衰期只有3.5天，因此考虑这些细胞可能是从初始的收缩型平滑肌细胞转换为不同表型的中间过渡状态。为了进一步明确这种过渡状态只存在高级别动脉粥样硬化斑块，作者取10周喂养小鼠的动脉粥样斑块（早期斑块）进行分析，出乎意料的是，几乎斑块中大部分平滑肌细胞为eGFP阳性而不是tdTomato阳性（Figure 4G-I），但成熟的纤维帽则主要是tdTomato阳性细胞（Figure 4E-F）。siRNA敲除Lglals3之后能够减弱平滑肌细胞的迁移以及多种胶原的转录活性，提示Lglals3不只是过渡状态的marker，而且具有相应的功能（Figure 4J）。
通过scRNA-seq分析鉴定，作者发现小鼠中的成骨样表型血管平滑肌细胞在人动脉粥样斑块中同样存在（Figure 6A）。共聚焦显微呈现提示，成骨样表型血管平滑肌细胞主要在破裂的动脉粥样斑块中存在而不是在稳定的粥样斑块（Figure 6C）。而稳定性斑块纤维帽高表达传统血管平滑肌细胞的marker-Atac2等，但是破裂的粥样斑块纤维帽中则并不存在（Figure 6B）。
好啦~本次文章的讲解到此结束了，高分文章的逼格果然还是满满的，我们常规看到的scRNA-seq只是通过对组织进行单细胞分离并测序，却并不能够准确的对细胞类型，尤其是细胞亚型进行准确的定义。Lineage tracing+scRNA-seq则能够完美解决这一问题，我相信这应该是以后的潜在趋势，通过lineage tracing确定细胞来源，通过scRNA-seq或者Cytof对细胞转录或蛋白特点进行定义，能够深入探索疾病中微环境状态细胞功能调控。好啦，我是风间琉璃，我们下期见~
往期传送门
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撰文丨风间琉璃
排版丨四金兄
主编丨小雪球
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关键词
基因
平滑肌细胞
动脉粥样
内皮细胞
小鼠
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