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大家好啊，我是风间琉璃。随着二代测序技术的发展，除了常规的转录组学分析外，还有对对表观遗传学进行探索的ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)和ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing)。作为在表观遗传学领域最常见的两项基于NGS的技术，我觉有必要更大家介绍一下。
正常的DNA双螺旋链是高度有序包装环绕组蛋白等构成异染色质的形态，从拓扑学结构上来说很难进行转录翻译成对应的蛋白。DNA的赋值和转录时，这种高度折叠有序的结构就会被打开，开放染色质允许转录因子等蛋白结合，这一区域的染色质就称之为开放染色质。而DNA转座酶的作用则是把DNA序列从一个区域搬运到另一个区域，只有在开放的染色质才能够与DNA转座酶结合。因此通过ATAC-seq能够明确开放染色质区域，从而进一步确认潜在的转录调控染色质区域。另外一方面，ChIP-seq主要分为组蛋白修饰的ChIP-seq和转录因子的ChIP-seq。
因为我们今天讲到的前者，所以就对前者进行背景介绍。组蛋白的修饰常见的有甲基化和乙酰化修饰两种，比如H3K4me3、H3K27ac。组蛋白修饰能够通过改变染色质构象或招募转录因子从而影像基因表达。通过组蛋白特异性抗体，将带有特定修饰的组蛋白-DNA复合物沉淀下来，从而获取该组蛋白结合的DNA片段。通过对DNA片段进行高通量测序，即可获得该组蛋白在染色体上的分布情况。ATAC-seq和ChIP-seq经常联合进行使用。
接下来我们就学习一篇今年7月发表在心血管内科顶刊《Circulation》杂志上联合ATAC-seq、ChIP-seq和RNA-seq的高分范例吧~
m6A系列传送门
在降糖治疗的条件下，糖尿病患者中的心血管风险仍然很高。有研究表明，在II型糖尿病中，降糖治疗对于降低动脉粥样硬化相关结局，比如急性心肌梗死的几乎只有轻度甚至没有作用。但具体潜在的机制并不明确。另一方面，巨噬细胞作为动脉粥样硬化全部过程中具有核心作用，并且根据不同微环境的刺激展现出不同的功能，也叫做不同的亚型。其中M1型（pro-inflammatory），主要是由LPS以及IFN-γ刺激诱导形成，而M2型（tissue reparative），主要由IL-4刺激诱导形成。最近的研究表明，巨噬细胞以及单核细胞的代谢改变能够通过表观遗传组学和染色体结构层面的改变导致长期的固有免疫反应（也就是标题中的trained immunity）。并且作者假设高糖能够诱导巨噬细胞的trained immunity，并且持续促进动脉粥样硬化的特征。
有氧糖酵解能够促进M1基因表达，高糖同样促进M1相关基因表达，所以作者推测细胞外高糖能够促进糖酵解，从而导致巨噬细胞的M1极化。通过对高糖vs对照处理的单核细胞代谢组学分析，高糖组具有显著的TCA（三羧酸循环）、pyruvate metabolism（丙酮酸代谢）等通路的激活（Figure 1a），琥珀酸（succinate）、苹果酸（malate）（Figure 1b）、乳酸（lactate）以及丙酮酸（pyruvate）（Figure 1c）的表达水平明显上调。代谢物富集分析同样提示有氧糖酵解的Warburg Effect明显富集（Figure 1d）。并且高糖组和对照组相比，具有较高的细胞外酸化率、糖酵解ATP速率以及较低的ATP率指数（Figure 1e-h）。
另一方面，在骨髓来源的巨噬细胞中，高糖能够促进M1型巨噬细胞的marker-IL6、iNOS表达并且能够抑制M2相关的makers-Ym1、Fizz1的表达（Figure 2a-d）。并且在dichloroacetate（DCA，糖酵解抑制剂）处理后能够抑制对应的变化（Figure 2a-d）。同样地，高糖能够促进小鼠单核细胞的黏附（Figure 2e、g），并能够促进骨髓来源巨噬细胞摄入修饰LDL形成泡沫细胞（Figure 2f、h）。
接下来作者对于骨髓来源的巨噬细胞进行诱导分化为M1和M2类型（Figure 3a）。在对应的LPS+ IFN-γ/IL-4/control刺激下，对应的M1（IL-6）明显上调和M2（Ym1、Fizz1）marker明显下调（Figure 3d-e）。提示诱导之后，糖尿病小鼠来源的巨噬细胞仍然表现出M1的表型。接下来作者进行RNA-seq分析，在PCA降维分析中进一步提示LPS+IFN-γ刺激下糖尿病小鼠骨髓来源的巨噬细胞和正常小鼠骨髓来源的巨噬细胞展现出明显的差异（Figure 3f）。最后热图提示LPS+IFN-γ和正常组间的M1和M2相关marker都具有明显差异（Figure 3g）。
接下来作者通过LPS+IFN-γ vs unstimulated刺激下观察糖尿病小鼠和对照组小鼠来源巨噬细胞的黏附和脂质区域。同样地在LPS+IFN-γ刺激下对应的黏附功能（Figure 4a、c）和脂质细胞（Figure 4b、d）明显增强。
在动物模型上，作者通过糖尿病小鼠和对照小鼠骨髓移植到动脉粥样硬化易感的Ldlr-/-小鼠，并评估主动脉根部的动脉粥样硬化（Figure 5a）。并且通过绿色荧光蛋白（GFP）来评估是否移植成功。并且糖尿病小鼠来源骨髓移植的小鼠，动脉粥样硬化的斑块区域更大（Figure 5c-d）。综上所述，作者将高糖对动脉粥样硬化促进作用以及M1巨噬细胞marker基因的高表达视作为为trained immunity的记忆（memory）反应。通过免疫荧光染色，作者发现巨噬细胞相关的H3K4me3在接受糖尿病小鼠骨髓移植的动脉粥样硬化斑块中明显上调（Figure 5e-f）。
接下来作者进一步对糖尿病小鼠vs对照小鼠骨髓来源的巨噬细胞进行ATAC-seq和RNA-seq分析。在unstimulated的条件下，与对照组相比，糖尿病组巨噬细胞具有1047个差异区域（Figure 6a），但是在炎性刺激之后，只有40个差异的开放区域（Figure 6b）。相反地，在unstimulated条件下，糖尿病组巨噬细胞具有632个（324个上调，308个下调）明显表达差异的基因；而在刺激之后，具有1348个（324个上调，308个下调）差异表达的基因。除此之外，作者还对糖尿病组vs对照组间造血干细胞和巨噬细胞进行组蛋白（H3K27ac和H3K4me3）的ChIP-seq分析。并通过PCA分析展示糖尿病组vs对照组间组蛋白激活区域的明显差异（Figure 6c）。接下来作者还对ATAC-seq鉴定unstimulated条件下糖尿病组的巨噬细胞的开放区域和组蛋白修饰区域取交集，其中大部分区域集中在增强子区域。通过差异分析，只有糖尿病组造血干细胞具有更高的启动子区域相关的表达（Figure 6d）。
另外作者根据ATAC-seq得到的差异peak的log2FC和RNA-seq得到的差异基因log2FC进行相关性分析，发现两者之间具有很强的相关性（Figure 7a）。作者通过IGV进一步可视化驱动炎症的分子（IL6）和糖代谢分析（Hk1）在ATAC-seq、H3K4me3 ChIP-seq和H3K27ac ChIP-seq数据的糖尿病组vs.对照组中表达量的差异（Figure 7b）。提示在糖尿病组明显上调。
接下来通过unstimulated条件下糖尿病组造血干细胞的的ATAC-seq的motif分析，其中富集motif结合的转录因子包括RUNX1、CTCF、PU.1（Figure 8a）。在LPS+IFN-γ刺激下，有95个RUNX1的靶基因表达明显差异（Figure 8b）。接下来通过对人来源的颈动脉斑块测序分析，同样提示在糖尿病组vs非糖尿病组动脉粥样斑块巨噬细胞差异基因中，有较大一部分是RUNX1相关的基因（Figure 8c）。接下来为进一步明确RUNX1在高糖诱导的trained immunity的反应，通过RUNX1的特异性抑制剂Ro5-3335对该过程进行逆转（Figure 8d）。结果提示在糖尿病组明显上调炎性相关的marker—IL6, IL1β能够被不同浓度的Ro5-3335进行抑制（Figure 8d-e）。
总结一下，本文和经典的论证多个分子变量逻辑的文章不同，主要亮点是不同模型嵌套（高糖模型+炎症刺激模型）、不同表型嵌套（代谢改变+免疫反应）、多组学分析（ChIP-seq+ATAC-seq+RNA-seq）以及复杂的动物模型。所以，我们在学习一篇高分文章的时候，就需要像酸菜老师和小雪球老师说的，不仅需要学习术（ChIP-seq+ATAC-seq+RNA-seq等技术）完全掌握，还需要学习文章里面蕴含的道（文章的思路，逻辑论证的环节）。
同学们，加油，继续努力学习吧~我是风间琉璃，咱们下期见。
往期传送门
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END—
撰文丨风间琉璃
排版丨四金兄
主编丨小雪球
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关键词
细胞
蛋白
染色质
巨噬细胞
组蛋白
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