27+最新m6A套路拆解！老板抠门又爱画饼的进！超高性价比，学会起码10+起步
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探索生信之美，领悟每篇文章背后的逻辑
大家好，我是风间琉璃~前面我们一起学习了m6A的相关下游分析，如果我们继续打通m6A的上游相关分析流程。接下来做一些湿实验，那么m6A这样热点我们是不是就算做下来了。但是千里之行，始于足下，从理论到实操有很多门槛需要我们跨越。比如对m6A下游分析可视化不熟悉的同学就可以参考我们前写的推文。那么在思路方面，就需要大家多阅读文献了，当你看完m6A相关综述，进一步关注你在意的疾病中m6A相关的文章时，你就会发现，文章并没有这么多，对吧。作为样本，那么今天跟大家分析一篇m6A干湿结合的高分文章解读，希望大家对m6A的干湿结合的理解更上一个台阶。文章标题“ALKBH5 suppresses malignancy of hepatocellular carcinoma via m 6 A-guided epigenetic inhibition of LYPD1”于2020年发表在《molecular cancer》杂志上。Molecular cancer的名号都有所耳闻了。2020年影响因子27.40，这样的影响因子提升速度，如果自己的SCI有这速度就好了。好，话不多说，我们就直接开始细细解构这篇文章的研究姿势。
m6A系列传送门
m6A作为新型的表观调控方式，在肝细胞肝癌（HCC）中具有重要的作用。而AlkB homolog 5 (ALKBH5)，作为其中一个m6A去甲基化酶，在HCC中的作用并未明确。作者发现m6A的eraser ALKBH5能够介导LYPD1的表达和m6A甲基化修饰水平改变从而能够HCC疾病进程的起调控作用。
作者首先比较了ALKBH5在癌和癌旁之间的RNA和蛋白的表达水平，发现ALKBH5明显在HCC下调（Figure 1a-c）。从另一独立数据集的免疫组化表达情况同样证明了这一结果（Figure 1d-e）。接下来KM曲线展示ALKBH5的下调是HHC患者的危险因素(figure 1f)。最后多因素分析提示ALKBH5是独立的预后因素（Figure 1g）
（Figure 1）
首先作者制备ALKBH5的siRNA，发现敲低ALKBH5后，肝癌细胞系增殖功能提高，而过表达ALKBH5后，增殖功能下降（Figure 2a）。相似的，EdU实验分析童颜展示ALKBH5对肝癌细胞系得抑制作用（Figure2b-e）。为了进一步证明ALKBH5得抗癌作用，作者进一步在动物模型上进行验证，发现敲低ALKBH5后的肿瘤重量和体积明显增加，过表达ALKBH5后肿瘤得重量和体积明显减少（Figure 2f-g）。
（Figure 2）
作者通过transwell、wound healing assay发现ALKBH5得敲低或者过表达能够导致肝癌细胞系得迁移能力下降或者增加（Figure 3a-b）。接下来作者通过phalloidin staining展示在敲低ALKBH5后细胞骨架得变化（Figure 3c-d）。接下来通过bioluminescence imaging展示在小鼠模型中肿瘤转移情况，发现ALKBH5得沉默能够促进肿瘤得转移（Figure 3 e-g）。
（Figure 3）
作者首先通过dot blot assay 发现ALKBH5对肝癌细胞系m6A的修饰作用。ALKBH5下调导致肝癌细胞系的m6A水平增加，而过表达则相反（Figure 4a）。为了进一步明确ALKBH5调控得直接机制，作者使用了MeRIP-Seq联合RNA-Seq分析ALKBH5过表达和对照组的RNA表达和RNA得m6A位点修饰水平。一共发现在ALKBH5过表达组1538个下调得差异m6A peak，以及481个下调转录本。作者这时候取了一个交集（Figure 4b），从而找前10个基因作为下游候选靶基因（Figure 4b-c）。并通过qPCR验证下游靶基因得表达水平（Figure 4d-g）。最后只有LYPD1和ALKBH5具有负向调控关系（Figure 4h）。
（Figure 4）
作者通过上面的MeRIP-seq分析明确LYPD1的3’UTR区域的m6A peak明显下降（Figure 5a）。为了进一步验证这一结果，作者通过RIP富集ALKBH5极其结合片段，发现LYPD1明显富集（Figure 5b）。接下来作者进一步通过MeRIP-qPCR，设计特定的引物从未明确了LYPD1的位点（Figure 5c）。接下来通过luciferase reporter基因实验进一步明确发现LYPD1-WT的活性更高，当ALKBH5沉默时（Figure 5d）。并且抑制的结果在ALKBH5过表达细胞中同样出现（Figure 5e）。除此之外，作者还发现ALKBH5过表达/敲低能够减少/增加LYPD1的降解时间（Figure 5f）。接下来作者通过对m6A调控机制的探索，m6A reader IGF2BP1的敲低能够导致LYPD1的明显下调（Figure 5g）。接下来作者进行过表达分析，展示了相同的结果（Figure 5h）。并且敲低ALKBH5的同时敲低IGF2BP1能够降低LYPD1的过表达。
（Figure 5）
通过LYPD1的敲低，检测LYPD1对细胞的增殖和活性影响（Figure 6a-b）。EdU检测结果和CCK-8和集落形成实验的结果一致（Figure 6c-d）。并且LYPD1的敲低同能能够抑制肝癌细胞系的迁移（Figure 6e-f）。接下来作者在动物模型进一步验证LYPD1的敲低能够显著抑制异植肿瘤的生长（Figure 6g-h）。接下来作者通过生物信息学方法，比较了在TCGA和GEO数据库中HHC样本的癌和癌旁的LYPD1的表达水平，并根据LYPD1的表达水平高低分组，比较两组间的预后差异（Figure6i-j）。
（Figure 6）
为了进一步肝癌细胞系的增殖和迁移表型是通过ALKBH5- LYPD1轴进行调控的，作者进一步进行rescue实验。通过过CCK-8和集落形成实验，敲低ALKBH5对肝癌细胞系增殖的促进作用被 LYPD1的沉默逆转（Figure 7a-d）。敲低LYPD1同样能够消除ALKBH5敲低对肝癌细胞系的迁移能力的促进作用（Figure 7e-g）。除此之外wound healing assay同样验证ALKBH5- LYPD1的因果调控关系（Figure 7h）。
（Figure 7）
ALKBH5和LYD1的临床相关性。作者通过ALKBH5和 LYPD1免疫组化结果，其中62.2%的样本低表达ALKBH5同时具有更高水平的LYPD1，而66.7%高表达的ALBH5样本展示出LYPD1低表大（Figure 8a-b）。接下来作者通过两个独立的GEO数据库展示出LYPD1和ALKBH5的负相关（Figure 8c）
（Figure 8）
总结下，作者从m6A相关调控基因出发，验证ALBKH5在肝细胞肝癌中的作用，接下来通过m6A-seq等预测手段，找到ALBKH5下游的靶向RNA——LYPD1，从而发现ALBKH5- LYPD1轴在肝细胞肝癌进展过程中的重要机制。
好啦，我是风间琉璃，学习完高分m6A文章套路，大家还担心实验没思路吗？大家加油，抓紧学起来！
往期传送门
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END—
撰文丨风间琉璃
排版丨四金兄
主编丨小雪球
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