见微知著——外泌体再掀生命科学热潮


利剑出鞘——华美高效率提取“纳米胶囊”
美国抗衰老医学研究会主席
Ronald Klatz 博士（抗衰老临床医学的先驱和主要权威人士之一）
曾表示：「外泌体是干细胞技术的下一个发展方向」。

外泌体于1983年首次在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现且能被多种细胞分泌，当时外泌体的发现并没有引起太多关注，被认为仅仅是成熟的红细胞的废物。
2013年，外泌体因诺贝尔医学奖而被众人知晓，也因此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。外泌体在体液中广泛存在及易获得性等特点被誉为液体活检"新秀"，成为疾病的精确诊断和治疗研究的热点。
外泌体是什么
外泌体（Exosomes）是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150 nm 的具有脂质双层膜的微小膜泡，它广泛存在并分布于血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等多种体液中。
外泌体携带和传递重要的信号分子，包含细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白质，参与细胞活动的重要调控，形成了一种全新的细胞间信息传递系统。其影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
外泌体的表面marker主要有CD9、CD63、CD81、PKM、ENO1、TSG101、热休克蛋白家族等。其中脂质双分子层中含有丰富的Phosphatidylserine。

▲图片来源：Exosomes:Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology

外泌体研究热潮不减
通过长久以来不断进化，大自然创造并优化了这些“纳米胶囊”，用于在人体各组织间传递分子。如今，外泌体在生物技术方面的潜力受到了重视。
外泌体研究已经成为近年来SCI期刊和基金资助的双热点。
近年来外泌体相关研究驶入快车道，高分文章更是频频发表。据统计，Pubmed收录的外泌体研究相关文章数量呈逐年递增态势。2020年文章量高达4277篇，较2019年增长近32%。而2021年上半年文章量已累计近3000篇，一路高歌猛进，呈现暴风增长。

▲图：近十年外泌体研究相关文章数量

(来源：Pubmed)
而美国资助基金的外泌体研究项目迅速增加，目前已资助"外泌体"课题达5563项。其中正在资助的470项课题中，外泌体研究涉及神经系统、细胞外基质、mRNA、干细胞、T细胞、癌症、免疫、病毒感染、心血管疾病及HIV感染、囊性纤维化、败血症等广泛领域。

▲图：外泌体研究涉及领域

制药巨头扎堆 瞄准外泌体黄金赛场
在资本的助力下，外泌体在治疗和诊断方向的应用也从实验室的研究阶段迅速推进，迎来了产业化合作新浪潮，成为下一个群雄角逐的黄金赛场。外泌体产业在欧美日已蓬勃发展，迄今为止，全球约有40多家外泌体治疗和诊断的公司。

▲外泌体公司列表

2020年6月份，礼来、武田、拜耳宣布了与外泌体公司高达20亿美元的交易。其中，礼来与英国Evox Therapeutics 签署了一项价值 12 亿美元的合作协议，未来双方将利用Evox专有的外泌体药物递送平台，开发RNA干扰和反义寡核苷酸药物有效递送载体，用于神经系统疾病的治疗。
今年2月18日，位于英国的Evox Therapeutics从OrbiMed和谷歌风投筹集了6920万英镑（约9540万美元），以推进其外泌体疗法进入临床试验，专注于可用装载蛋白质或RNA的外泌体治疗的罕见疾病。
全球许多生物技术公司竞相开发外泌体，例如Exosomics、Carmine Therapeutics、Vesigen Therapeutics、Mantra Bio和Aruna Bio等。近年来，很多国际制药巨头也纷纷投入这个领域来，罗氏（Roche）、武田、礼来已经分别与拥有这一创新技术平台的公司达成多项高额合作，开发外泌体靶向疗法。在投资者日益增加的资金支持的刺激下，该领域或将在未来几年掀起一波热潮。希望随着研究的开展和技术的进步，外泌体作为药物载体的研究可以取得快速的进展和新的突破。
 外泌体市场/临床应用
作为液体活检领域的"三大标杆"之一，外泌体被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体，外泌体通过其携带的脂质、核酸、蛋白质、miRNA等来调节受体细胞的生物学活性，从而参与机体免疫应答、细胞迁移、肿瘤侵袭、抗原提呈等生物学过程。大量的证据表明外泌体及其内容物具有成为新型诊断标志物的潜能，在临床和治疗方面展现出了极具前景的研究价值。
外泌体在肿瘤中的应用前景非常广阔。在液体活检层面，外泌体相对易于获取，携带足够的生物信息，因此能够携带肿瘤早期标志物信息，提供早期诊断的机会。对于中晚期患者而言，外泌体能够用于治疗标志物预测，帮助临床选择治疗方案，同时在治疗过程中提供动态监控，帮助更好地获益。
外泌体与细胞膜融合可将所携带的物质和信号传递到受体细胞并改变其生物学功能，因此，外泌体是纳米药物递送或基因治疗的潜在载体。也可以将外泌体作为药物递送的媒介，为其构建靶向性，使其用于递送治疗剂，从而扩展现有精准治疗的给药方式。
前期研究发现，外泌体可自发富集于肝脏，因此，载药外泌体在治疗肝脏相关疾病如原位肝癌、肝衰竭、肝纤维化和脂肪肝等疾病方面具有巨大的应用前景。自然分泌的外泌体分离纯化直接作为药物的潜力有限，但是，将自然的外泌体分泌所需组分掺入合成脂质体或纳米颗粒中，并且使用可控程序组装后的工程化外泌体模拟物在药学上拥有更大的应用潜力。
外泌体分离提取
研究外泌体内涵成分的前提是对其进行高质量的提取，由于外泌体粒径较小且与多种其他生物分子混合在一起，导致其分离纯化困难，阻碍了对其的进一步研究。
近年来，研究人员根据外泌体理化性质研发了多种分离纯化方法：常用的有超速离心法、密度梯度超速离心法、超滤法、多聚物沉淀法（PEG）、免疫磁珠法、试剂盒分离法等。
而对于外泌体的分离，首先要关注外泌体的提取质量，包括纯度、囊泡状态、得率及重复性等方面的评估，然后才是技术路线的选择。  
⊙超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，目前已发表文献引用最多的方法，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。
优点：无需特殊试剂，操作简便，适合大批量样本。
缺点：耗时耗力，纯度相对较低，回收率不稳定，重复离心会一定程度损伤外泌体，设备要求高。
⊙密度梯度超速离心法是在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/mL的密度范围富集。
优点：纯度相对较高，适合大批量样本。
缺点：步骤繁琐，耗时，回收率不稳定，重复离心会一定程度损伤外泌体，设备要求高。
⊙超滤法是将溶剂及小分子物质过滤到膜的另一侧，而将相对大分子物质截留在超滤膜上，以达到分离的目的。
优点：简单高效，不影响外泌体的完整性。
缺点：外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率和纯度较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。
⊙多聚物沉淀法根据化合物与外泌体的理化特性，利用共沉淀或者反向筛选的方式对外泌体进行分离纯化。
优点：操作简单、耗时短、无设备限制。
缺点：纯度较低，存在假阳性（杂蛋白较多或一些难以去除的聚合物），机械力或化学添加物对外泌体产生破坏，存在于分离物中的聚合物也可能会干扰下游分析等。
⊙抗体亲和（磁珠）法利用包被单克隆抗体的磁珠结合外泌体，外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。
优点：纯度较高，特异性和重复性好、操作简便、无设备限制。
缺点：效率和回收率较低，仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，囊泡完整性影响较大。
综上所述，现有技术的方法提取到的外泌体，缺陷在于：收率较低，耗时长、纯度不高，外泌体囊泡不完整等。
鉴于上述问题，武汉华美生物工程有限公司研发的外泌体提取试剂盒提供了一种简单可靠的方法可从细胞培养上清液，血清，血浆，乳液，尿液，唾液，酵母，植物中提取完整的外泌体。该产品提取的外泌体囊泡适用于下游的电镜分析、NTA分析、纳米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、荧光定量（qPCR）和高通量测序等应用。
该试剂盒通过蛋白亲和的方式分离外泌体，无需超速离心即可实现高效率地从各种类型样本中提取高纯度、囊泡结构完整的外泌体，具有简便、稳定、易操作的优点：
  • 适用于各种样品类型(细胞培养上清液，血清，血浆，乳液，尿液，唾液、酵母、植物)
  • 适用于各种细胞上清液中外泌体的分离提取(A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)
  • 所提取的外泌体囊泡结构完整，呈球形或碟形，颗粒均匀
  • 高产量，单次提取，可获得3*1011‍‍‍‍‍‍‍‍个/mL 外泌体囊泡
  • 操作简单无设备要求（不需要超速离心）
武汉华美生物工程有限公司(www.cusabio.cn)成立于2007年12月，是一家集科研、生产、销售为一体的生物高新技术企业。并形成了以CUSABIO为品牌的ELISA试剂盒、蛋白、抗体等多种优质产品，远销欧美日德等九十多个国家。

2018年3月31日，华美生物兄弟公司生之源与2013年诺贝尔生理学或医学奖得主兰迪·谢克曼教授举行签约仪式，并建立诺贝尔奖工作站。此举大大助推了华美外泌体相关科研产品的研究和生产！
华美生物研发的外泌体(Exosome)提取试剂盒广泛兼容各种样本类型和各种细胞上清液(如A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)，为广大生物医学科研学者提供高质量的产品与技术服务。
外泌体研究吸引着生命科学各个领域的科学家。华美CUSABIO提供外泌体提取试剂盒，将助力研究人员探秘其功能，扩大其医学应用。
☆外泌体相关标志物精品抗体：
GAPDH Monoclonal Antibody (CSB-MA000071M0m)
CD9 Monoclonal Antibody (CSB-MA004969A0m)
CD63 Monoclonal Antibody (CSB-MA004950A0m)
ENO1 Monoclonal Antibody (CSB-MA007670A0m)
PKM Monoclonal Antibody (CSB-MA018072A0m)
外泌体未来展望
外泌体爆炸性研究活动已经慢慢演变为分子医学的快速发展。外泌体在临床医学中有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态、诊断疾病、治疗反应、疾病进展等。重要且有影响力外泌体研究领域会随着高效率的外泌体分离技术的发展而发展。
外泌体可作为生物标志物用于疾病的诊断，也推动了以外泌体为靶标的治疗方法研究或将外泌体本身用作治疗工具的研究。将外泌体用作治疗工具的临床研究正在开展之中，其目的是研究患者自身MSC分泌外泌体或健康捐赠者体内外泌体用于治疗的安全性和有效性。这个趋势下，外泌体用作药物输送系统作为基因治疗的潜在载体有可能变得更加普遍。外泌体在癌症中同时发挥免疫激活和免疫抑制功能，外泌体肿瘤免疫疗法有望诞生抗癌疫苗。
外泌体作为疾病诊断标志物的潜在应用依赖于基于外泌体的药物递送系统的技术突破，理论上能够从外泌体中检测到DNA序列变异、RNA的表达变化、蛋白质变化等。要将其用于临床治疗，外泌体的大规模工业化生产还面临很大的挑战。首先，对外泌体的具体合成机制、功能了解并不是非常详细。其次，存在外泌体分离技术、分离量、及检测技术的挑战，外泌体在肿瘤学中的应用还需要加强和深入研究。然而，虽然当前外泌体生物学仍然不成熟，但越来越多的兴趣和资金投入必将加速外泌体基础研究进展和临床转化。
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关键词
泌体
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囊泡