撰文│刘薇   何志颖
编辑│陈圆圆
审校│汤红明
本文详细讨论了从多能干细胞向肝细胞分化方案的技术改进，以及迄今为止开发的临床方法及其临床应用前景。
【据《Hepatology》2021年1月报道】题：人多能干细胞分化成肝细胞的新技术及其临床应用（作者Eléanor Luce等）
肝移植是目前几种严重肝病，如急性肝功能衰竭、终末期肝病、原发性肝癌和某些遗传疾病等的唯一治疗方法。术后免疫排斥以及供肝数量短缺问题让肝细胞移植成为一种具有替代肝原位移植的潜在治疗方法。但是肝细胞移植同样存在原代肝细胞不足的问题，从人类多能干细胞(hPSCs)扩增并分化成肝细胞成为一种很好的选择。本文详细讨论了从多能干细胞向肝细胞分化方案的技术改进，以及迄今为止开发的临床方法及其临床应用前景。
2007年，高桥和山中成功地将人类成体细胞重新编程为类胚胎细胞，即人类诱导多能干细胞(hiPSCs)。从那时起，几种重编程技术和体细胞类型被用于获得hiPSCs。hiPSC的分化方法能提供几乎无穷无尽的肝细胞来源，可以满足研究和治疗应用的需要。尽管PSCs分化后获得的肝细胞更类似于胎儿/新生儿肝细胞，表达胎儿形式的白蛋白和有限的细胞色素活性。但它们已被有效地用于慢性肝病或急性肝衰竭(ALF)动物模型的移植。这表明，由PSC诱导得到的肝细胞在体内可以继续成熟，这也说明了分化细胞的不成熟可能不是它们用于移植的障碍。
1.
多能干细胞诱导生成肝细胞的2D培养系统的进展
（1）小分子的添加
2D培养体系中一般均需添加细胞因子和生长因子。除此之外，一些小分子的添加被陆续发现可以促进PSC的转化效率。这些分子包括CHIR99021（激活WNT/β连环蛋白通路的小分子）以及Ly294002（PI3K抑制剂，在分化的最初几天与激活素/节点通路协同作用）。在内胚层分化阶段，加入维甲酸、染色质修饰剂二甲基亚砜(DMSO)或WNT/βcatenin通路抑制剂IWR-1也可以增强PSC向肝脏谱系的分化。最后，通过化合物E抑制NOTCH通路或通过小分子SB431542抑制TGFβ通路可抑制肝细胞的胆管细胞向分化，从而促进肝细胞谱系增殖。在促进诱导方面，化学小分子的优势在于其质量稳定，可重复性高，且易于被GMP规范接受。
（2）hPSC来源的肝细胞共培养
共培养系统已经在人原代肝细胞（PHH）来源的肝细胞体外培养中证明了其有效性和功能性。因此，很多研究小组也尝试在PSC分化过程中引入共培养体系：在存在成纤维细胞、肝基质细胞和非实质人肝星状细胞的情况下，对hPSC来源的肝细胞进行共培养。有数据表明，在hPSC来源的肝细胞样细胞(HLCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的共培养体系中，对细胞性能的改善主要是由于共培养培养基，而不是共培养HUVECs细胞的存在。
（3）细胞外基质
肝细胞是极化复杂、黏附性强的上皮细胞，需要多种因素的复杂相互作用才能在体外维持其生理特性和肝功能。而肝脏对异质的代谢和运输功能主要依赖于肝细胞极化，这与细胞和细胞基质相互作用密切相关。因此，可模拟肝细胞体内微环境（cell niche）的人工构造(如纳米纤维、薄膜或水凝胶)已被开发出来，以增强肝细胞的黏附、迁移和增殖。这些支架通常由天然聚合物如胶原蛋白、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、琼脂糖或合成物质如聚ε-己内酯(PCL)和聚L-乳酸(PLLA)制成。这些结构的应用，显著改善了hPSC来源的HLC的极化。此外，一些报道表明，使用去细胞的人肝细胞外基质对hiPSC进行分化培养，与标准分化培养相比，可以导致肝细胞功能上调。
（4）流体化微芯片（Fluidised micro-chips）
微芯片通常由透明、疏水和生物相容性的材料（如聚二甲基硅氧烷）制成。通过不同处理，芯片的表面属性可以被修改，再对芯片添加微流控系统模拟血管系统，输送氧气和营养物质并排空废物。因此，芯片可以最大程度的模拟体内细胞所处的微环境。实验证明，这一体系可以为肝细胞分化提供有利的微环境。此外，有报道称在芯片上创造了从常氧到严重缺氧的氧浓度梯度，这使得模拟肝脏中产生的生理氧梯度成为可能。这对形成体内的肝小叶结构及肝脏zonation的研究非常有帮助。
2.
hPSC向肝细胞分化的3D培养系统进展
3D培养体系（如图）在PHH细胞的体外培养中可以延长其体外培养时间，同时保持特异性标志物的表达和CYP活性。实验证明，hiPSC肝细胞分化过程中，3D培养体系也可以得到相同的结果。
（1）类器官
目前已经可以得到完全由hiPSC来源细胞构成的类器官（organoid）。这个领域目前研究的一个方向是构建肝细胞与星状细胞或胆管细胞的共培养系统，试图在类器官中形成胆道网络，以达到类器官的长期培养。
（2）生物打印
生物打印是通过计算机控制，以细胞或细胞聚集体为材料，逐层或逐点构建组织和器官的技术。目前已经有研究使用hESC-HLCs在海藻酸水凝胶中，或使用hiPSC-HLCs在白明胶中进行生物打印，生成的肝细胞群体与2D培养相比，具有更好的alb分泌能力，尿素产生能力以及多种细胞色素P450高表达。
（3）微芯片
微芯片可以模拟体内细胞环境，包括等效的血流。实验证明，与常规培养方法相比，对3D培养的HepG2球状体进行模拟血流的培养方法后，这一球状体可显著改善肝脏特异性功能和代谢活性。类似的，与静态系统相比，hiPSC-HLC共培养细胞形成的类器官被包含在3D流化芯片中后，其肝脏特异性功能显著增强，包括白蛋白和尿素生产以及代谢能力。
微芯片也可以与生物打印方法结合使用，使用生物打印的HepG2球状体而不是单个细胞生成的类器官加载微芯片培养体系，以期待获得更好的肝细胞群。
由于生物打印和微芯片是设计、工程和人造的，其体内应用受限于人类对于器官及其功能的认知。
（4）封装系统（Encapsulation systems）
封装是将细胞包裹在半透性的水凝胶球中，水凝胶可以根据需要进行化学修饰以适应其孔隙度。该技术使营养物质、氧气、二氧化碳和信号分子可以通过凝胶球交换，同时允许生长因子、代谢物和废物的扩散，但防止了抗体渗透。已经有实验证明，使用海藻酸多聚赖氨酸球包埋细胞，可以维持细胞活力，并允许干细胞分化为肝细胞。同时，研究证明在小鼠体内植入被包裹的hiPSC-HLCs聚集物后，其血液中分泌的人白蛋白水平与PHHs类似。
3.
hPSC分化产生肝细胞形成的类器官在临床治疗应用上的限制
（1）实用操作问题
自体分化细胞的移植不仅需要将患者的细胞重新编程成hiPSCs，还需要对单基因疾病的基因进行纠正并诱导它们向肝细胞分化。这些步骤可能需要3~4个月，并不适用于病情较重的患者。此外，临床级hiPSC-HLCs的生产成本约为 200,000 美元/患者，成本高昂。基于这些原因，异体移植策略具有显著的优势。因此，发展维持肝细胞功能的低温保存方法是必要的。另一个问题在于，目前很难达到PSC细胞大规模培养。因此，类器官生产的标准化和自动化（至少部分自动化），对于推广这一技术的临床应用是必须的。
最后，肝细胞的植入方式也必须在评估各种方法的风险后予以确定。举例来说，门静脉注射似乎更受欢迎，因为它可以将大量细胞输送到肝窦，并且在没有肝纤维化的患者中耐受性良好，但这一方法可能引发门静脉压力升高和门静脉血栓形成。
（2）安全问题
对最终应用的肝细胞产品本身的质量控制，不仅在功能方面，而且在安全方面，需要被定义。使用干细胞衍生的细胞所固有的一个问题与细胞的潜在遗传不稳定性有关。PSCs的基因组完整性必须得到保证，即使并非所有的突变都会导致不良影响或肿瘤。目前，细胞在分化成hiPSC-HLCs过程中基因组完整性的保存缺乏文献记载，而且尚未建立分化方案和其遗传完整性之间的联系。这方面还需要进一步的研究。
最终治疗产品中可能存在的残余hPSCs也必须考虑在内，即使一些研究已经报道了分化肝细胞的移植，在2D或3D条件下，并没有在小鼠中形成任何畸胎瘤或肿瘤。
最后，hPSC来源细胞的免疫源性必须被考虑。目前的研究中，部分被免疫系统很好地耐受，但也有报道指出不同的免疫反应取决于所使用的细胞系。
（3）伦理问题
在细胞治疗中使用hPSC - HLCs涉及到有关其人源材料和hESCs潜在用途的伦理问题。在这方面，适用于世界各地的准则范围，从全面禁止到管制授权。然而，hiPSCs由于是由体细胞产生而绕过了胚胎破坏的伦理问题。
在所有情况下，细胞治疗、基因治疗和组织工程需要根据生物医学或再生医学领域技术的进步和PSC研究等新领域的出现迅速改变立法。
4.
结论
由于PHHs在体外快速丧失肝脏功能，hiPSC来源的分化肝细胞是很有希望替代移植肝细胞的来源。3D培养系统已适应于PSC的分化，明显提高了hESC和hiPSC向肝细胞转化的效率。这些新的培养技术的潜力令人兴奋，但3D结构的分析需要开发特定的Protocol和仪器。
随着3D培养技术的发展，HLC不完全成熟的问题似乎可以得到解决，临床级PSC-HLCs的治疗应用开始出现。但为了未来临床应用的进一步发展，跨细胞生物学、临床护理、生物工程和生物相容性材料科学的跨学科合作非常必要。
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关键词
细胞
多能干细胞
肝细胞
方法
技术