Nature Medicine万字综述阐述肿瘤的这个重要特征

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肿瘤内异质性对肿瘤进展和免疫治疗的影响

肿瘤治疗的过程中，经常发生治疗抵抗，除了肿瘤细胞内部的进化，肿瘤本身存在的异质性也是一个非常非常重要的因素。以前我们的研究都是把混合组织作为一个整体进行研究，随着技术和研究方法的进步，如单细胞测序等技术的发明，人类对存在于肿瘤内部的异质性有了更多了解。2021年威尔康奈尔医学院的Lorenzo Galluzzi教授和意大利Candiolo癌症研究所的Ilio Vitale教授联合在国际著名的《Nature Medicine》杂志上发表了题为《Intratumoral heterogeneity in cancer progression and response to immunotherapy》，系统性的阐述了肿瘤内异质性对肿瘤进展和免疫治疗的影响。

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摘要

大多数肿瘤是在营养、代谢、免疫和治疗因素所施加的强大进化压力下发生和发展的。这些因素对肿瘤进化的相对影响会随着时间和空间的变化而变化，最终有利于肿瘤微环境的建立，这种微环境的所有成分都表现出相当大的遗传、表型和行为异质性。在本综述中，我们讨论了肿瘤内异质性的主要来源及其对疾病自然病程的影响，包括对治疗的敏感性，也勾勒出了针对侵袭性恶性肿瘤这种有害特征的潜在策略。

引言

过去十年所开展的大量工作使得科学家能够复现多种癌症中癌细胞的细胞结构、功能特性和演变过程。现在清楚的是，大多数肿瘤有着复杂的生态系统，它们在来自微环境强大选择压力下出现和进化，微环境包括营养、代谢、免疫和治疗成分。这种压力促进了肿瘤微环境（TME）的恶性和非恶性（即内皮、间质和免疫）隔室（compartments）的多样化，最终导致了一定程度的瘤内异质性（ITH），从而促使疾病进展并对治疗产生抵抗力。

多区域基因组测序研究结果显示，恶性肿瘤细胞的遗传构成不仅在不同的解剖位置和疾病阶段（例如，原发和转移病变）上存在相当大的差异，而且在同一肿瘤的不同区域也存在着相当大的差异，这就是众所周知的空间ITH。沿着类似的思路，纵向研究已经证明，同一病变的遗传特征可以随着时间的推移而显著变化，这被称为时间性（temporal）ITH。重要的是，ITH不仅表现在遗传水平上，还包括表观遗传、转录、表型、代谢和分泌成分。这些成分可以彼此独立地变化（例如，遗传稳定的肿瘤却表现出高度的表观遗传变异性），或者以紧密相互联系的方式变化（例如，基因和表观遗传变化协同定义转录和表型特征）。

此外，ITH还影响TME的非恶性部分，包括（但不限于）肿瘤相关成纤维细胞（CAF）和肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL），以及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和树突状细胞（DC）等各种髓系细胞。因此，TME的每个细胞成分的丰度、定位和功能定位都会随着时间和空间的演变而变化，从而决定了ITH。

这样的时空进化是由其来源的动态性质决定的，其中包括肿瘤细胞固有的（intrinsic）过程，如遗传不稳定，以及TME的特征，如特定生长因子、营养物质和免疫调节剂的局部可获得性。克隆选择、合作和竞争的机制是在恶性细胞和TME的其他细胞隔间（compartments）之间多方向相互作用的背景下进行。例如，虽然恶性肿瘤细胞中的各种遗传和表观遗传缺陷会影响TIL的丰度和活性，但后者的效应活性对肿瘤的增殖潜能和克隆形态有重要影响。

两个共同的原则支配着TME所有隔间中ITH的演变。首先，每种类型的细胞似乎都存在于表型和/或行为状态的连续体中，这些状态与一定程度的可塑性有关，而这种可塑性也使得对微环境扰动的反应可以迅速转变。其次，ITH（及其来源）只能耐受到一个特定的阈值，超过这个阈值不仅会危及细胞存活，而且隔室或整个肿瘤的结构也会受到威胁（图1）。重要的是，当肿瘤逃避自然免疫监视、进展和抵抗（免疫）治疗时，ITH对于肿瘤的发生（emerge）至关重要。因此，在各种肿瘤环境中，高遗传性和非遗传性ITH与较差的患者预后相关。然而，定义ITH及其时空演化的关键特征仍然在很大程度上是未知的。在这里，我们讨论ITH的主要来源及其对疾病进展和治疗敏感性的影响，以及针对侵袭性肿瘤这种不利特征的潜在策略。

癌细胞的动态异质性

基因异质性

对患者活检组织的单样本或多样本测序研究描绘了肿瘤的突变景观及其进化轨迹，展示了在空间和时间维度上广泛的遗传性ITH（图2）。已检测到体细胞单核苷酸变异、短插入或短缺失（INDELs）、拷贝数变异以及染色体结构和数目的变异。在肿瘤进展和治疗反应的过程中，这些基因改变可以在所有癌细胞（即克隆性的）或一部分（即亚克隆性的）癌细胞中产生和积累。在这种情况下，克隆性（这是遗传ITH的衡量标准）不仅取决于潜在遗传伤害的类型和严重程度，而且还取决于（1）涉及的基因组区域和（2）决定克隆适合性（fitness）的内在因素（例如基因组不稳定性）和外在因素（例如克隆竞争和免疫监视）之间的平衡。

目前的观点是遗传性ITH对癌细胞的增殖、侵袭和抗药性至关重要，因为它赋予不断进化的肿瘤可塑性。因此，克隆多样性为肿瘤的进化提供了肥沃的土壤，最终形成了诸如肿瘤突变负荷（TMB）和核型（karyotypic）图谱等基因组特征，以及（以互惠互利的方式）肿瘤的致癌组分（makeup）和免疫原性。进展中的肿瘤倾向于获得驱动突变，这些突变有利于至少一定程度的遗传不稳定（例如，DNA修复基因的突变）、治疗耐药性（例如，PTEN缺失）和免疫逃逸（例如，MHC I类编码基因的丢失）。这种改变通常是通过趋同（convergent）进化引起的，例如在抗PI3K抑制剂的转移性乳腺癌患者中观察到PTEN的聚合性缺失，以及在一些肺癌和其他逃脱免疫监视的肿瘤患者中MHC I类基因的丢失。

由于驱动基因突变通常会带来生存和/或生长优势，因此在大多数原发性癌症中，它们被积极选择并成为显性克隆，尽管随着肿瘤的进展可能会出现一定程度的亚克隆性。相反，乘客突变（不提供选择优势）的进化是中性的，它们的分支进化被认为是已确立的肿瘤中克隆多样性的主要来源。

遗传性ITH对肿瘤的抗原性图景（landscape）有重要影响。肿瘤新抗原（TNA）是肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的重要靶点，蛋白编码基因的非同义突变和INDELs是肿瘤新抗原（TNAs）的主要来源。值得注意的是，在大多数肿瘤中，不仅有数目上的基因改变，而且在疾病进展过程中其类型也有变化，最终导致产生区域性和时间性（temporal）的新抗原亚克隆模式。此外，亚克隆性的核型改变在染色体不稳定性（CIN）水平较高的肿瘤中反复出现，也说明了体细胞拷贝数变异与肿瘤进化的相关性。所有这些过程都有重要的治疗意义，因为在许多肿瘤环境中，提高克隆多样性会对疾病结局和治疗敏感性产生负面影响。事实上，在体细胞突变和拷贝数变异方面，高度但可耐受的（tolerable）ITH对各种实体肿瘤患者而言是一个负面的预后因素。

表观遗传异质性

越来越多的证据表明表观遗传过程在ITH中起着相关的作用。因此，虽然参与正常发育的表观遗传途径是建立和维持细胞命运决定的关键，但癌细胞利用表观遗传畸变很容易在细胞状态之间转换。在进展性肺癌和复发性胶质母细胞瘤中已经检测到DNA甲基化模式的时间性变化。同样，不同的表观遗传过程，包括组蛋白乙酰化、染色质重塑和非编码RNA的基因调控，已经被证明可沿着空间和/或时间维度来展示ITH。虽然这些表观遗传学改变通常是可逆的，但这些表观遗传学改变可以由细胞后代获得，从而影响肿瘤的克隆图景及其进化。

此外，它们还可以通过解除对驱动基因和/或潜在抗原实体（entities）编码基因的调控来影响肿瘤的增殖及其免疫原性，包括TNA、（潜伏的）病毒蛋白和肿瘤相关抗原（TAA是由于野生型蛋白发生过度表达或异位表达而产生的，对这些蛋白的中枢耐受是有漏洞的）。在包括急性髓系白血病（AML）、尤文肉瘤和肝细胞癌在内的各种肿瘤患者中，恶性细胞中的表观基因组ITH一直与不良的疾病结局有关。

行为（behavioral）和免疫异质性

最终，遗传和表观遗传过程勾画了转录、蛋白质组和表型模式，这些模式在与TME的元素（包括营养和免疫线索）相互作用时，决定了行为（behavioral）和免疫学ITH。行为性ITH影响与疾病进展有关的相当“经典”的过程，如增殖特性和侵袭性，而免疫性ITH则围绕抗原性（免疫系统可识别的细胞特性）、佐剂（可启动免疫反应的细胞特性）和免疫逃避（可抑制或逃避免疫的细胞特性）。因此，肺癌和肝癌的基因组和转录学研究表明，具有不同转录调控和增殖率的肿瘤区域通常表现出不同的T细胞浸润或激活模式。此外，多区域单细胞RNA测序（RNA-seq）检测到肺癌中与免疫相关的基因在空间和时间维度上都存在相当程度的转录水平的ITH。

有趣的是，恶性肿瘤细胞中ITH的某些成分，如代谢性ITH，似乎会影响行为和免疫性ITH之间的界限（interface）。例如，高度糖酵解的癌细胞不仅可以将葡萄糖重定向到合成代谢反应以支持增殖，而且还可以分泌更多的乳酸，从而发挥免疫抑制作用。新陈代谢的灵活性实际上是肿瘤进展的一个主要特征，这可能反映了对环境信号做出微调新陈代谢的能力所赋予的多方面的选择性优势。

的确，在非小细胞肺癌中，葡萄糖代谢的异质性模式与包括乳酸在内的不同碳源的优先使用有关。此外，代谢分析显示胶质母细胞瘤中存在快速和缓慢增殖的细胞亚群，分别表现为糖酵解代谢与化疗敏感性或氧化代谢与化疗耐药的耦合（coupled）。黑色素瘤的癌细胞亚群表现出更高的代谢异质性（包括利用细胞外乳酸作为碳源的能力）和高度转移潜能，这表明多种肿瘤可以利用代谢ITH来支持进展。有趣的是，最近的研究表明代谢异质性（如小儿室管膜瘤中缺氧引起的代谢异质性）也可以导致大规模的表观遗传性ITH。

单细胞转录学的研究也证明了存在分层组织的（hierarchically organized）癌细胞亚群，它们利用提升的（elevated）可塑性作为行为性ITH的来源。因此，发育分析显示在多种肿瘤中存在分化状态和干细胞潜能不同的恶性细胞亚型，包括AML、胶质瘤和髓母细胞瘤。这些亚群的相对丰度在不同的肿瘤类型和同一类型的癌症中都有显著差异。此外，这些癌细胞亚群显示出不同的免疫原性潜力，至少在胶质瘤中，能够在表型状态之间切换。有趣的是，肿瘤干细胞，被认为推动了大多数人类肿瘤起始、进展和治疗耐药的免疫豁免（immunoprivileged）细胞亚群，表现出核型和表型的ITH，这表明至少一定程度的ITH可能是肿瘤进化所必需的。

免疫基质模式（immune-stromal patterns）的动态异质性

免疫基质结构

最近，大量的单细胞RNA-seq和质谱研究提供了对各种人类肿瘤的细胞架构的深入见解，包括霍奇金淋巴瘤、胶质瘤和黑色素瘤，以及乳腺癌、结直肠癌、肺癌和肾癌。揭示了ITH不仅在患者之间存在很大的变异性，而且在很大程度上影响恶性细胞和TIL、TME的其他免疫细胞（即DC和TAMS）和CAF。这些研究确定了T细胞的不同亚群，它们位于TME的特定解剖位置，与正常组织相邻，或存在于外周血中。

浸润实体瘤的主要T细胞群包括效应T（TE）细胞（介导针对现有抗原的效应器功能）、常驻（resident）记忆T（TM）细胞（充当哨兵，可以对既往抗原的重新出现做出快速反应）、调节性T（Treg）细胞（介导免疫抑制效应）和耗尽的T细胞（由于慢性抗原暴露而功能失调）（图3）。在RNA-seq和质谱研究中，T细胞亚群的特征通常包括分化状态（例如，幼稚细胞与Teff或Treg细胞）、增殖能力（例如，静止细胞与周期细胞）、克隆性（即特定T细胞克隆在T细胞亚群中的相对丰度）、效应分子的表达，如IFN-γ，以及代谢特征（例如糖酵解与氧化）。

总而言之，这些特征通常被用来定义特定T细胞的功能特性，从而定义其抑制或支持肿瘤生长的能力。然而，TIL（以及TME和CAF的其他免疫细胞）并不一定呈现两种相反的状态，而是存在于一系列高度可塑性的功能表型中，这些表型有助于时空ITH（图1）。因此，很明显，促炎M1样和抗炎M2样TAMs的这种二分法区分是一种过于简单化的方法，并不能正确反映TAM隔室（compartment）的复杂性。同样，共抑制受体——程序性细胞死亡1（PDCD1，即最为人所知的PD-1）在肿瘤浸润的CD8+T细胞中的表达不足以定义耗竭，因为它似乎与一系列功能状态共存，包括具有（至少一些）效应活性的状态。

此外，即使是真正功能失调的T细胞也表现出高水平的ITH，这与功能障碍的T细胞是黑色素瘤等肿瘤中最丰富的T细胞亚群有关，在这些肿瘤中，它们表现出出人意料的高增殖和克隆性扩张率。值得注意的是，肿瘤浸润性免疫细胞存在的状态谱似乎是相对保守的，即使是在不同患者的不同肿瘤中也是如此。相反，每个细胞亚群的相对比例表现出相当程度的异质性，潜在地表明不同免疫细胞状态之间的平衡是调节抗肿瘤免疫反应的主要因素。

空间分布

免疫和间质TME的局部分布、相对丰度和功能定位在很大程度上取决于微环境的特征（例如局部含氧量）和恶性细胞本身所施加的进化压力，包括PD-1配体CD274（众所周知的PD-L1）等表面蛋白以及免疫抑制细胞因子TGFB1等分泌因子。重要的是，所有这些特征在不同的肿瘤区域可能有很大的不同，因此以空间异质性的方式影响疾病的进展和对治疗的反应。

故，虽然所谓的“热”肿瘤通常对各种治疗方法敏感，包括免疫检查点抑制剂（ICIs）免疫治疗，因为它们的TME富含CTL，而它们的“冷”肿瘤却表现出对治疗的抵抗力增强，反映出TME的T细胞浸润有限。同样，“排除”（excluded）的肿瘤对治疗相当不敏感，因为CTL被免疫抑制信号或致密的间质限制在TME的外围。后一种情况说明了空间ITH对于癌症进展和治疗反应的重要性，而不仅仅是数字上的考虑（排除的肿瘤确实面临/对抗着大量的CTL）。

也就是说，仅根据热/冷/排除的三联体（triad）对实体肿瘤的免疫-间质模式进行分类也还是过于简单化的。事实上，已经确定了大量的免疫细胞亚型，每种亚型都表现出不同的功能和空间格局，并与特定的临床参数相关。例如，三级淋巴结构（TLS）是树突状细胞、B细胞和T淋巴细胞的高度组织化和功能性聚集，最近已被证明是启动抗癌免疫的关键部位，对疾病结局有显著影响，至少在一些肿瘤中是如此，包括肉瘤、黑色素瘤和肾癌。值得注意的是，Treg细胞也表现出（至少在一定程度上）与空间ITH相关的功能异质性。具体地说，虽然一些Treg亚群在空间上局限于抗原呈递缺陷的区域，但其他亚群似乎存在于富含CAF的肿瘤区域。

时间（Temporal）异质性

重要的是，TME的免疫和间质部分都对微环境条件非常敏感，因此（自然地和治疗后）会动态演变来决定疾病结局。最近的一项单细胞RNA-seq研究显示，在从非侵袭性不典型增生到侵袭性胰腺导管腺癌的过程中，TME的细胞成分发生了很大的变化。这些变化包括CTL和DC的耗尽，伴随着免疫抑制细胞的积累，如髓系来源的抑制细胞和特定的CAF亚群。在各种进展性肿瘤（包括乳腺癌、肺癌和胰腺癌）的TME中，也观察到效应细胞功能降低、克隆性受限和T细胞组分耗竭增加，常常伴随Treg细胞聚集和CAF组分扩大。

同样，多区域测序研究表明，免疫和间质组分具有相当大的空间异质性。例如，同一卵巢癌患者的不同转移灶已显示出分别与进展和消退相关的冷或热免疫学特征。在肝细胞癌、高级别浆液性卵巢癌和非小细胞肺癌的个体患者中，在不同的肿瘤性病变或同一病变的不同区域中，免疫间隔区也有类似的ITH。在这种情况下，特定肿瘤区域（以及空间ITH）的（亚）克隆构型似乎受到免疫系统功能定位的强烈影响。加强了时空ITH对疾病预后的重要性，个体患者的冷区域或病灶的数量似乎与疾病控制和良好的预后呈负相关。

免疫编辑

在前面提到的大多数情况下，获得性免疫只在肿瘤区域发挥作用，并显示出不断演变的TNA图景，表明克隆进化是由免疫细胞（免疫编辑）决定的。因此，对肺和食管肿瘤活检组织的多区域测序研究表明，TIL隔室（compartment）和TCR谱系中增高的空间ITH与局部非同义突变或新抗原的数量有关。也就是说，大多数肿瘤浸润性CD8+CTL对肿瘤来源的抗原表现出有限的（尽管异质性）反应性，这表明它们对肿瘤生长的影响可能源于旁观者效应。此外，这些研究大多没有仔细考虑特定免疫亚群的迁移能力和肿瘤浸润性免疫细胞可从循环或邻近正常组织中得到补充，这对于解释免疫性ITH在空间和时间维度上都是非常重要的。

间质中的空间ITH也被认为是影响肿瘤间质对疾病进展和治疗反应的影响的一个因素。例如，在肺癌的肿瘤内皮细胞（TECs）中发现ITH水平升高，不仅描述了具有“常规”内皮功能的TEC簇，还描述了具有显著免疫调节活性的TEC亚群。尽管TECs的时间性ITH仍未得到充分研究，但人们很容易推测，它们在系统性波动方面的第一线位置需要较高的可塑性，从而具有明显的进化能力，以应对营养、代谢和治疗方面的挑战。

ITH的内在和外在决定因素之间的相互作用

ITH起源于多个来源，由许多因素决定，所有这些因素都可以随着疾病进展而在空间和/或时间维度上有所不同。在这种情况下，有一个主要的发育部分是可行的（operational），因为起源的细胞和组织最终决定了特定肿瘤随着进展和治疗反应而具有多样化的倾向。此外，组织特异性是TME免疫、间质和内皮隔室的关键决定因素。在组织学决定因素的背景下，各种遗传和表观遗传缺陷，以及环境因素和治疗因素，都是恶性和非恶性细胞中ITH的主要推动者。

基因组不稳定

基因组不稳定性是ITH的一个主要来源，它是大多数（如果不是全部）实体肿瘤（或其区域）的一种异常状态，使癌细胞特别容易积累基因变异。微卫星不稳定性（MSI）有利于DNA错配修复（MMR）缺陷下游短重复DNA链的扩张或收缩。在包括胃食管腺癌和胶质瘤在内的多种肿瘤中，MSI与极端的ITH有关，通常伴随着大量的TIL浸润和较好的预后。事实上，MSI-高（MSI-H）肿瘤通常呈现出突变表型，这增加了它们产生可被免疫系统识别的TNAs的可能性。

根据这一概念，在乳腺、结直肠和胰腺癌细胞中实验性诱导MSI会导致突变和新抗原负荷的增加，最终导致在免疫活性宿主中肿瘤的有限生长。有趣的是，MSI直接与一个表观遗传标记（组蛋白H3在Lys36的三甲基化）相连，该标记是招募MMR异二聚体复合物mutS homolog 2（MSH2）-MSH6所必需的。因此，携带Lys36三甲基化所需的组蛋白H3残基突变（例如，Gly34）或含有2，组蛋白赖氨酸甲基转移酶（SETD2，催化三甲基化的组蛋白赖氨酸甲基转移酶）的SET结构域缺陷的肿瘤通常表现出较高的突变频率和MSI。随着其他DNA修复基因（例如POLD1和BRCA2）的突变，解除APOBEC家族胞苷脱氨酶的调控，以及CIN背景下出现的核型异常，ITH增加伴随着局部免疫成分的变化也被观察到。

克隆选择和免疫逃逸

遗传和表观遗传事件构成了ITH的进化基础，但许多因素在空间和时间维度上塑造了ITH。克隆选择就是这样的决定因素之一，在肿瘤发展的早期阶段起着重要作用。事实上，TME的恶性和非恶性组分不断地相互竞争营养物质、氧气和营养因子，这些物质在肿瘤或其区域的进展中可能会减少。其他TME因素的局部改变或时间改变，包括血管化、硬化和炎症，也会形成ITH。此外，新出现的肿瘤（亚）克隆受到来自适应性免疫系统的强大选择压力，适应性免疫系统通过免疫编辑形成克隆结构（从而形成遗传和表观遗传的ITH）。

在这种情况下，癌细胞利用各种机制来逃避免疫系统的识别和消除（所有这些机制都源于现有的ITH，并在额外的ITH的背景下使疾病进展）。这些机制包括抑制抗原表达下游的有限抗原性或抗原呈递分子机制的缺陷，以及癌细胞佐剂的改变和高度免疫抑制的TME的建立。值得注意的是，抗原丢失似乎发生在特定的肿瘤区域（空间ITH）和疾病进展过程（TIMAL ITH），尽管抗原选择与未治疗肿瘤进展的相关性仍有争议。

值得注意的是，免疫逃逸可以直接通过ITH促进癌细胞中的基因变异来实现。这些突变包括控制基因组稳定性的基因突变，如MYC原癌基因、bHLH转录因子（MYC）、KRAS原癌基因GTPase（KRAS）和肿瘤蛋白p53（TP53），其改变可促进共抑制分子的表达，如PD-L1、CTL排出和/或免疫抑制细胞的浸润；代谢适应性，如PTEN和STK11，其突变会抑制CTL募集。同样，表观遗传控制基因的解除调控（deregulation），如EZH2或DNA甲基转移酶1（DNMT1）的会削弱癌细胞的抗原性（MHC I类下调的下游）或佐剂（抑制促炎细胞因子分泌的下游）。

最后，在所有TME隔室之间复杂的多方向相互作用的背景下，ITH在空间和时间上进化。例如，恶性细胞和髓样细胞都可以通过暴露或释放包括危险信号、生长因子、细胞因子和细胞表面蛋白在内的各种免疫调节因子来改变免疫性TME的分布和功能定位。类似地，特定的CAF亚群可以通过分泌细胞外基质成分和促纤维化细胞因子（例如TGFB1）直接影响免疫TME，从而有利于CTL的排出或免疫抑制因子，也可以间接地通过改变癌细胞的增殖率、干性和代谢来影响TME。

在这种情况下，癌细胞也可以通过多种机制支持CAF的异质性，包括以TGFB1为中心的旁分泌环。重要的是，参与TME空间和时间重构的各种信号来自将死的（dying）细胞，即使在没有治疗挑战的情况下，TME中也经常出现这种信号。这类信号的类型和丰度在很大程度上为受到应对微环境压力的细胞所激活的保护反应及其最终结局（即细胞存活与细胞死亡）的影响。

肿瘤内异质性对免疫治疗反应的影响

大量证据表明，ITH增加了恶性肿瘤细胞在常规化疗、放射治疗和靶向抗癌药物治疗中存活的可能性。此外，ITH对各种免疫疗法的疗效有重要影响，尤其是免疫检查点抑制剂（ICIs）。MMR缺陷的肿瘤对ICIs特别敏感，这在很大程度上反映了它们TNA负荷和免疫浸润的增加，这项观察结果支持历史上第一次批准PD-1阻断剂pembrolizumab用于治疗MSI-H肿瘤，而不考虑组织学来源的这一现实情况。

然而，并不是所有MMR缺陷的肿瘤都对ICIs有反应，获得性耐药机制可以在过程中发展。事实上，在MMR缺乏的肿瘤中，MSI和CTL浸润的程度似乎是错杂的，导致抗原性有限且免疫控制不足的区域可能支持耐药性。此外，MMR缺陷肿瘤的高突变表型提高了抗原谱的可塑性，尽管有积极的ICI驱动的免疫，但事实上增加了出现抗原性差的癌细胞克隆的可能性。影响MSI-H肿瘤对ICIs反应的其他ITH相关变量包括它们在进展过程中所发生的强有力的（robust）免疫编辑和转换为糖酵解的倾向，这些过程都有利于免疫逃避的发生。

除了影响ICI疗效外，ITH还混杂（confounds）了临床上使用的疾病预后预测指标。TMB通常可以预测基于ICI的免疫治疗在多种癌症类型中的疗效，但在TMB升高的肿瘤中表现出了异质性反应，一些TMB有限的癌症却可以通过ICIs有效地控制。最近研究发现，TMB（因此是遗传性ITH）的过度升高与黑色素瘤免疫监视和免疫治疗反应的降低有关，至少部分原因是克隆分化。

在此背景下，TNA负荷的预测价值受TNA克隆性以外的ITH相关因素的影响，包括TNA产生突变的类型、发生率、来源和TNA质量，还受MHC单倍型和区域表达水平的影响。值得注意的是，高TMB的ICI无反应性肿瘤通常在抗原提呈方面存在缺陷。其他与ITH相关的TMB抵抗力/反作用力（counteracting forces）包括非整倍体程度的增加和随之而来的CTL排出、表观遗传学改变和控制免疫基因表达的染色质重塑、与干性相关的免疫逃避，以及与抗原呈递不良和免疫效应功能抑制有关的代谢特征。

诊断活检中的PD-L1水平也常被用来预测各种肿瘤患者的ICI 敏感性，但PD-L1的表达在很大程度上表现出空间和时间上的ITH，这是由于IFN-γ信号转导因子如JAK1和JAK2异质性的解除调节（deregulation）所致。这可能解释了为什么一部分PD-L1+肿瘤患者对ICIs没有反应，而一些PD-L1−肿瘤患者对ICIs反应强烈。ITH还影响TIL的预后价值，这在多种肿瘤中都有报道。TIL隔间（compartment）在本质上确实是不同的，不同的肿瘤类型、分期和区域在成分、分布、克隆性和功能定位上各不相同。

因此，ICIs的临床活性可能不仅依赖于肿瘤侵袭边缘（margin）丰富的CTL浸润和定位，还取决于特定CTL群体的相对丰度，包括（但不限于）明显的记忆样或耗竭的T细胞。此外，新出现的数据表明，包括CD4+T细胞、B细胞、TAMs、TLSs、DC、CAF和内皮细胞在内的各种TME成分/隔间（compartment）可影响ICIs的临床疗效。因此，进一步研究阐明这些成分/隔间（compartment）及其ITH对癌症患者免疫治疗疗效的确切贡献有着非常重要的意义。

重要的是，ICI对时间性ITH有直接影响，其特异性变化可预测抗肿瘤反应的程度和持久性。特别是，对ICIs起反应的MSI-H肿瘤通常表现出早期免疫编辑的迹象，包括TMB和TNA负荷的纵向（longitudinal）下降，这被归因于包括亚克隆TNAs缺失在内的TNA选择。

相反，在ICI的免疫治疗过程中出现抗原提呈和干扰素信号的缺陷，与黑色素瘤患者以及结直肠癌和肺癌患者的不良疾病预后有关。此外，对ICI有反应的肿瘤则表现出广泛的转录重塑，同时TIL隔间/组分（compartment）也向产生细胞毒作用的方向发生功能重排，进一步支持了ICIs的疗效需要重新激活（reinvigoration）原有CD8+T细胞免疫的观点。

然而，ICIs、ITH和特定靶点所驱动的效应反应的动力学仍然存在争议。在这一背景下，PD-1阻滞剂重新激活终末分化的耗竭CTL的假设已经被证据证明是肿瘤浸润性CTL发生弱活化（poor reinvigoration），肿瘤中驻留的耗竭T细胞前体细胞和干细胞样记忆CD8+T细胞的扩增，以及特定T细胞亚型的克隆性替换过程。因此，对ICIs的强敏感性（superior sensitivity）可能依赖于一小组在外周扩张增殖的异质性相对较差的新型T细胞克隆。然而，ICIs也影响Treg细胞和重塑髓样TME组分，因为它们可重新激活DC并招募获得异质性表型和行为状态的巨噬细胞，这表明ICIs的临床疗效可能涉及CTL以外的其他多种免疫细胞群。

靶向肿瘤内异质性的治疗策略

靶向ITH的来源

如上所述，ITH提供了一种促使肿瘤逃避免疫监视和抵抗治疗的方法，因此这也构成了一个有希望的治疗靶点（表1）。在这个意义上，一种潜在的方法依赖于靶向ITH的来源，基于两个相反的理由：ITH的过度升高可能被证明是癌细胞的适应性（fitness）所不能承受的，ITH的降低可能会（重新）恢复自然免疫监视以及对常规治疗或免疫疗法的敏感性。前一种方法可能更适用于在诊断时是高度异质性的肿瘤（即大体核型改变），因为之前已经证明这些肿瘤对额外程度的ITH是不耐受的。

事实上，据报道，针对有丝分裂分子机制组件的各种药物，如MPS1，都会由于严重加剧CIN而促进癌细胞死亡。相反，对于ITH基础水平有限的肿瘤，降低其ITH可能是更可取的，这可能需要靶向促ITH（ITH-promoting）过程的抑制剂，如表观遗传调节剂，或靶向耗尽促ITH的细胞亚群，包括（但不限于）肿瘤或转移起始细胞以及具有糖酵解特征的癌细胞亚群。其他需要注意的是，这些方法的特异性是有限的，这与TIL特别相关，TIL的表型分布、功能定位和效应功能都高度依赖于克隆结构、营养的可获得性、遗传稳定性和表观遗传的调节。

溶瘤作用（Oncolysis）

可以设想几种免疫学方法来靶向ITH，理想的是与可重塑耗竭的、免疫抑制的和/或纤维化的TME的策略相结合。这样的方法依赖于相对非选择性的细胞溶解，或药物或病毒对癌细胞的溶瘤作用，这些药物或病毒会导致免疫原性细胞死亡（ICD），这是细胞死亡的一种特殊的免疫刺激变体（variant）。在这种情况下，垂死的癌细胞在TME内释放大量的抗原、危险信号和细胞因子，潜在地导致激活有效的（potent）多表位免疫反应，从而克服（至少某种程度的）ITH。

溶瘤病毒（OV）可能对高ITH的肿瘤特别有效，因为它们对癌细胞的趋向性（tropism）相当不特异，这依赖于通常会产生有限ITH的细胞成分（例如，不受选择性压力情况下，病毒所进入的表面受体）。病毒溶瘤以ICD的强健波（robust waves）再加上可能建立允许（免疫）治疗的TME达到顶峰（culminates）。然而，OVs作为独立治疗药物的疗效也是有限的，而包括ICIs在内的联合疗法似乎是有效根除肿瘤所必需的。

肿瘤病毒（oncoviral）平台的其他限制与识别过程的精确时间表（schedules）有关，这些时间表（至少最初）能够使强大的病毒复制（这涉及到一定程度的免疫抑制）与随后的抗肿瘤免疫相结合。基于较差的表面特性（例如电荷），阳离子两性多肽可以实现类似的裂解策略，优先杀死癌细胞。

在临床前研究中，这些药物被证明能有效地诱导线粒体和网状室的ICD启动。尽管ITH较高，肽介导的溶瘤仍可导致大量的抗原释放、危险信号和CTL介导的抗癌免疫的启动。同样，放射治疗也可以通过ICD激活来启动下游的抗癌免疫，特别是在ITH高（通常表现为DNA修复缺陷）的癌症中。

然而，放射治疗也可以发挥多种免疫抑制作用，包括潜在的TGFB1激活，而且并不是所有的TME分区都表现出相同的放射敏感性，这意味着放射治疗实际上可能会促进而不是限制ITH（特别是在非恶性TME中）。值得注意的是，溶瘤肽和放射治疗在与ICIs结合时（至少在临床前肿瘤模型中）都特别有效，这一结果强调了这样一个事实，即强有力的治疗反应通常涉及整个TME朝抗肿瘤免疫方向的重组。

T细胞疗法

至少在理论上，针对ITH的第二种策略需要靶向恒定抗原的特异T细胞，例如整个恶性间隔共享的全克隆性TNA。这种方法需要对TNA环境进行深入的、多区域的剖析，同时对克隆性TNA具有特异性的TCR的患者来源T细胞进行设计（engineering）或选择。除了成本和可行性（一些肿瘤可能不表达可被靶向的克隆性TNAs）外，该方法的一个主要局限性是时间性ITH与TNA丢失有关。这个问题至少部分可以通过靶向由驱动基因的热点突变或致癌融合（通常不会丢失，因为它们是肿瘤生存或进展的基础）编码的TNA或由癌细胞恒定（homogeneously）表达的TAA（尽管与TNA相比，TAA通常是抗肿瘤免疫的较差的启动因子）来绕过这一问题。其他潜在的障碍包括T细胞耗竭的发生、免疫抑制或纤维化的TME，以及具有细胞死亡信号或抗原提呈缺陷的肿瘤的内源性抵抗力。

抗原提呈缺陷可以通过嵌合抗原受体（CARs）或靶向表面肿瘤抗原的双特异性T细胞结合蛋白（BiTEs）来规避，这两者都能在没有MHC分子提呈抗原的情况下激活CTL。尽管靶向CD19（一种常见的B细胞抗原）的表达CAR的T细胞已被批准用于某些B细胞恶性肿瘤的治疗，但CAR T细胞平台对实体瘤的疗效仍然很差，需要相当高的抗原密度，并引起与正常组织的靶标表达有关的毒性、细胞因子释放综合征或免疫性神经毒性。最后，抗原丢失是抵抗CAR T细胞的主要原因，也反应了CAR T细胞耗竭的情况。有趣的是，据报道，低剂量放射治疗可通过上调恶性肿瘤细胞上的死亡受体，触发CAR T细胞的抗原非依赖性杀伤作用，这是在抗原丢失的下游靶向ITH的一种有前途的策略。

另一种靶向ITH的MHC无限制的治疗策略涉及识别非肽类抗原（例如脂质和小代谢物）的非经典淋巴样细胞，这些抗原由单形（monomorphic）抗原提呈分子提呈，如CD1（由γδT细胞识别）和MR1（由粘膜相关的恒定（invariant）T细胞识别）。值得注意的是，各种癌细胞的表面都存在这样的分子。此外，最近发现了一种MR1限制性的T细胞群，能够识别迄今为止由恶性肿瘤细胞同源表达的未知配体，但不能识别健康细胞表达的配体。在这种情况下，MR1限制性T细胞可特异性地杀死癌细胞，而不论组织来源和MHC单倍型。

然而，MR1类似于传统的MHC I类分子，需要β2微球蛋白（B2M）来呈递。因此，MR1限制性T细胞可能对B2M位点杂合性缺失的肿瘤不起作用，而这是高ITH的肿瘤逃避免疫监视的常见机制。此外，MR1限制性T细胞对癌细胞的杀伤是否能产生长期的免疫记忆还有待阐明。解决这一问题和其他有关MR1依赖性呈递的未知因素，将有助于揭示MR1限制性T细胞作为靶向ITH的工具的真正潜力。最后，靶向ITH的潜在策略依赖于转基因（genetically modified）T细胞靶向多克隆和/或亚克隆TNA或TAA的重定向，这可能会大大降低（minimize）异质性肿瘤在抗原丢失时逃避识别的能力。然而，影响癌细胞对免疫效因子敏感性的基因缺陷（例如CASP8或JAK2突变），或导致局部免疫抑制（例如PD-L1上调），仍可能会抵消治疗的效果。

结束语

大量证据已经表明，ITH升高对包括免疫治疗在内的多种治疗的临床治疗效果有负面影响，这提示ITH是开发联合治疗方案的潜在靶点。然而，虽然在TME的恶性隔间内靶向空间性ITH可能是可行的（至少在理论上），但时间性ITH仍可能会出现（除非肿瘤被完全根除），并在发生治疗抵抗的情况下推动侵袭性疾病的进展。此外，大多数肿瘤通常是在恶性和非恶性TME间隔之间和内部存在多方向关系的情况下发展并对治疗产生反应的，而这可能提供了意想不到的机制来保持可塑性，尽管实施了治疗方案。阐明TME各隔室ITH的来源和ITH动态变化的关键时空特征对于开发治疗高ITH肿瘤的有效方法具有重要意义。

在这种情况下，通过表征（和治疗性开发）TME独特表型和功能可塑性的（一些）分子机制已取得了重大进展。这些途径包括（但不限于）控制免疫和基质细胞功能定位的复杂信号网络，这些细胞通常被恶性肿瘤细胞劫持以获得营养支持，逃避自然免疫监视，并抵抗（免疫）治疗。重要的是，这其中的大多数过程都是由表观遗传机制调节的，因此有可能被逆转用于治疗目的。此外，TME的恶性和非恶性部分在代谢性ITH和可塑性方面似乎有所不同，这也可能为治疗干预打开了一扇窗。

现在很清楚，所有的（免疫）治疗方法都对空间和时间性的ITH有重大影响，而ITH反过来又会影响治疗反应的程度和持久性。准确了解对治疗有响应或抵抗的肿瘤微环境中ITH的空间和时间模式，不仅可以识别预测生物标记物，还可以表征新的治疗靶点。以ICI为基础的免疫治疗为例，阐明ICIs对CTL以外的免疫细胞亚群（例如非常规T细胞）的确切影响，以及迄今还知之甚少的过程（例如T细胞重新激活（rejuvenation）和克隆替代）或结构（例如TLSs）相关性是非常重要的。

鉴于所有的这些考虑，我们认为应该努力重新思考癌症治疗，不仅要考虑到肿瘤生态系统的组成，还要考虑到肿瘤生态系统的异质性和可塑性，以及存在于TME隔室（compartments）之间的相互作用，以及它们在癌症进展和治疗反应过程中的演变方式。