作者 | 刹那小公子

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洛克菲勒大学的Charles M. Rice因为其对HCV的卓越研究,获得了2020年诺贝尔生理学和医学奖。其实验室不仅长期致力于HCV的研究,其对各种突发性病毒传染病也非常关注,比如寨卡病毒(Cell,2017)和近期肆虐的新冠病毒。


近日,Rice团队利用CRISPAR技术,分析了宿主蛋白对冠状病毒感染和复制的影响,为寻找冠状病毒通用治疗靶点提供了实验依据。该文章发表于最新一期的Cell子刊Cell Host&Microbe。


1.通过CRPSPAR-Cas9进行正向遗传学筛选寻找潜在靶点


针对新冠病毒的药物,一方面可以特异性的针对该病毒的毒力因子,例如N蛋白和ORF3a蛋白;同时,病毒作为寄生生物,其生命周期依赖于宿主细胞,因而其需要劫持并利用宿主细胞,完成自身复制和持续侵染。Rice团队从该角度出发,为了寻找潜在的依赖性宿主蛋白,该团队依托26种新冠蛋白与人类宿主蛋白的作用图谱(Nature,2020),针对332个目的蛋白,设计了sgRNA文库,并利用CRISPAR-Cas9正向遗传学筛选的方式,来验证其是否参与新冠病毒的感染和复制。


其基本原理是,利用慢病毒载体表达针对332种基因的sgRNA(每个基因10对sgRNA,共3320个),312个安全的阴性对照(针对非基因区域)和310种阳性对照(针对细胞生存和增殖的必要基因)。转染后筛选出sgRNA阳性细胞,并用新冠病毒感染这群细胞,然后提取DNA进行测序。该系统采用的是Huh-7.5细胞,该细胞被新冠病毒感染后会迅速发生死亡。培养温度为33度和37度,分别是上呼吸道和下呼吸道的温度。


理论上,新冠病毒依赖的宿主基因被敲掉后,病毒对该细胞的感染势必减弱,因而这群细胞会成为主要细胞群;而新冠病毒不依赖的基因被敲掉后,其感染不会发生变化,细胞会迅速死亡,因而该细胞群会相对弱势并最终消失。因而,从测序结果种就可以分辨出,332个目的蛋白是否参与病毒的感染。

 

2.验证潜在靶点


基于CRPSPAR-Cas9进行正向遗传学筛选结果证明,VSP11,Rab10等参与内吞体和溶酶体功能的蛋白,对于新冠病毒的感染至关重要。为了进一步验证测序所得到的结果,Rice团队利用Huh7.7和A549细胞重复了上述实验,通过siRNA敲低VSP11等基因,检测手段换为免疫荧光检测新冠病毒N蛋白。可以看到,23个潜在靶点,大部分确实参与了新冠病毒的感染。

 


3.冠状病毒家族对宿主蛋白以来的共性和异性


我们知道,来源于同一家族的病毒,其进化上具有相关性,在致病机制上具有一定的相似性。其对宿主蛋白的依赖,不仅具有特异性,也具有共性。为了更近一步的研究冠状病毒和宿主的相互作用机制,以及寻找针对该病毒类群的共同靶点,Rice团队使用另外三种人类冠状病毒,即HCoV-229E, HCoV-NL63, 和HCoV-OC43,分别重复了筛选,并于新冠病毒的结果进行比较。该团队发现,四种病毒均强烈的依赖于Rabs和HOPS相关蛋白,而新冠病毒则高度特异性的依赖于胆固醇稳态相关蛋白。


总结该研究系统的阐释了四种不同的冠状病毒与宿主蛋白的关系,解释了溶酶体通路,胆固醇代谢通路是新冠病毒重要的作用位点。对于我们针对特异性靶点开发治疗药物和治疗方案,具有重要的指导意义。一方面,治疗位点可以作用于宿主蛋白;另一方面,治疗位点也也可以作用劫持该宿主蛋白的病毒毒力蛋白。


参考链接:https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S1931-3128%2820%2930671-5

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