medRxiv预印本丨双嘧达莫对具有凝血功能异常的COVID-19患者的治疗作用

责编丨兮

2020年2月29日，中山大学罗海彬、武汉大学中南医院周芙玲、广州医科大学张玉霞、广州医科大学第一附属医院赵金存和西藏大学洪学传合作在预印版平台medRxiv上发表文章Therapeutic effects of dipyridamole on COVID-19 patients with coagulation dysfunction，揭示了双嘧达莫（DIP）可有效地帮助病毒感染的机体恢复免疫力，阻止病情向重症以及危重症发展。

摘要

HCoV-19感染重症患者可出现急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、高凝状态、高血压、肺外多器官功能障碍和较高的死亡率。已发表的治疗指南通常包括抗病毒、抗菌药物和生命支持疗法，但仍迫切需要安全有效的抗凝药物改善整体预后。我们以HCoV-19蛋白酶Mpro（又名3CLP或nsp5）为靶点，对FDA（食品药品监督管理局）批准的药物数据库进行了筛选，发现双嘧达莫（Dipyridamole, DIP）结合Mpro。体外实验发现DIP抑制HCoV-19复制的EC50可低至100nM。DIP激活抗病毒的I型干扰素通路并在病毒性肺炎模型中显著改善肺损伤。在使用DIP进行辅助治疗的12例HCoV-19感染患者的临床试验中，我们发现DIP辅助治疗可显著升高血小板和淋巴细胞计数，降低D-二聚体水平。DIP治疗2周后，6例重症中的3例（50%）以及所有4例轻症（100%）

出院。1例在接受DIP治疗前就具有极高水平D-二聚体和淋巴细胞严重减少的危重症患者死亡。其他的患者目前都已进入临床康复期。总之，DIP的辅助治疗可以明显改善HCoV-19感染的患者的临床症状，机制可能与抑制病毒在体内的复制，抑制血液高凝状态，提高机体免疫力有关。对此，亟需大规模开展临床试验以验证DIP对HCoV-19的治疗效果。

新型冠状病毒HCoV-19（又称SARS-CoV-2）于2019年12月在中国湖北省武汉市爆发。截至2月24日，中国共有77,056例COVID-19确诊病例，包括2,446例死亡病例。日本、韩国、意大利、新加坡、伊朗、泰国和美国等28个国家也报道了超过2500例感染病例。到目前为止，对COVID-19的治疗还缺乏特效药。因此，探索已批准应用于临床的药物作为治疗COVID-19的潜在药物，利用研究人员积累的研究经验以及临床医生的用药经验，在疾病爆发之际辅助用药挽救患者生命，可以节省大量的研发时间和临床资源。

HCoV-19同SARS-CoV和MERS-CoV一样属于β-冠状病毒属，它们是一种具有包膜的、全长约30,000个核苷酸的正链RNA病毒。HCoV-19也是通过S-蛋白与人细胞表面ACE2受体的介导作用进行入侵。ACE2在人体多器官中广泛表达，包括肺、心、肾和肠。然而，在SARS-CoV感染的实验模型中，Spike蛋白的参与降低了ACE2的表达，激活了肾素-血管紧张素系统（RAS）。RAS的激活促进了血小板粘附和聚集，增加肺栓塞、高血压和纤维化的风险。同时，它还通过增加局部血管紧张素II浓度来加速心脏和肾脏的损伤。除了经典的RAS途径外，肠内ACE2缺乏与营养不良和结肠炎症有关。

与感染SARS-CoV的患者表现出的临床症状相似，在重症监护室（ICU）收治的COVID-19患者，也表现出凝血时间延长、D-二聚体阳性、严重淋巴细胞减少、ARDS、高血压和急性心脏损伤等临床症状。ACE2参与水解血管紧张素II，有报道称在HCoV-19感染的患者体内，血管紧张素II水平升高且与病毒负荷正相关[20]。这些数据提示临床治疗中，应用抑制通过ACE2进入体内的病毒的药物时应注意避免激活RAS。此外，还应预防性进行抗凝治疗，以降低严重COVID-19患者肺栓塞和多器官损伤的风险。

病毒进入宿主细胞后，冠状病毒信使RNA首先被翻译成多种蛋白质，随后由两种病毒蛋白酶：3C样蛋白酶（3CLP，又名nsp5或Mpro）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLP，又名nsp3）进行切割，以产生病毒复制所必需的非结构蛋白。因此，抑制这些蛋白酶活性或许可以抑制病毒的复制，为治疗HCoV-19提供思路。

双嘧达莫（DIP）是一种抗血小板药物，作为磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，可提高细胞内cAMP/cGMP水平。除了众所周知的抗血小板功能外，DIP可能有利于COVID-19患者的治疗。首先，在已发表的研究中，包括在中国开展的临床实验，都证实了DIP具有广谱抗病毒活性，尤其是针对正链RNA病毒。其次，它可抑制炎症发展并促进黏膜愈合。第三，作为泛PDE抑制剂，DIP可防止肺、心、肝、肾等器官的急性损伤和进行性纤维化。在本研究中，我们提供了3个层面的证据来支持DIP对HcoV-19病毒感染的治疗作用。首先我们发现DIP具有抗Mpro活性，因此可直接抑制HCoV-19的复制。其次在VSV诱导的小鼠肺炎模型中，DIP增强机体的抗病毒免疫力，降低死亡率。在开展的一个小样本量DIP辅助治疗COVID-19患者的临床试验中，我们发现DIP辅助治疗可提高循环中淋巴细胞和血小板计数，降低D-二聚体水平，临床疗效显著。

试验情况

患者和研究变量

截至2020年2月8日，武汉大学中南医院共有124例COVID-19确诊病例（表S1）。所有患者均符合国家卫生委员会办公厅制定的《新型冠状病毒感染肺炎诊断与治疗方案（第6版试行）》的诊断标准。对这些患者的医疗记录进行回顾性分析，以凝血指标和血小板为参数，包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体、血小板（PLT）计数和平均血小板体积（MPV）。根据C-反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）和白细胞介素6（IL-6）水平评估全身炎症反应。

研究设计

通过回顾性分析验证DIP辅助治疗的临床有效性。患者于2020年1月23日至2020年2月22日在中国湖北省大悟县人民医院隔离病房就诊，每天监测患者的病情，包括体格检查、毒性检查、胸部CT扫描和生化指标。在治疗过程中对凝血变量、血液指标、肝肾功能指标和胸部CT进行常规实验室检查。临床症状和实验室数据由两名专职调查人员记录，以确保数据的准确性。如果患者符合下列任何一项标准，则诊断为重症：（1）呼吸频率≥30次/min；（2）血氧饱和度SpO2≤93%；（3）PaO2/FiO2≤300mm Hg。如果符合下列任何一项标准，则诊断为危重症：（1）呼吸衰竭，需要机械通气；（2）休克；（3）合并多器官功能衰竭，则需转入重症监护室（ICU）。大悟县人民医院伦理委员会批准了此次临床试验。所有参与的患者或者家属签署了知情同意书。

治疗过程

治疗方案双嘧达莫150毫克/天，分三次口服，持续用药7天。每日监测患者状态。所有患者均接受抗病毒（利巴韦林，0.5g，Q12h），皮质激素（甲泼尼龙琥珀酸钠，40mg，qd），氧疗，必要时给予营养支持。

结果

DIP抑制HCoV-19病毒的复制

我们筛选了获得FDA批准的药物库，发现DIP可以结合HCoV-19的蛋白酶Mpro。疏水作用力和氢键（H-键）是DIP与Mpro结合的主要驱动力。根据自由能扰动计算，DIP和Mpro之间的结合自由能DGpred为-6.34k cal/mol。采用SPR法测定了DIP与Mpro在体外的结合亲和力。实验证实DIP与Mpro的结合亲和力为34μM（KD，eq）。

为了检验DIP是否对HCoV-19复制有直接的抑制作用，我们利用细胞系检测了DIP刺激后的病毒滴度。氯喹作为阳性对照。我们发现0.1μM的DIP可以显著抑制50%的HCoV-19病毒的复制。在人体给与DIP，药物的血液浓度可达3uM。因此，治疗剂量的DIP或许能有效抑制HCoV-19在体内的复制。然而与氯喹相比，DIP对HCoV-19病毒复制的剂量依赖性抑制作用并不显著，提示DIP可能利用不同机制对病毒起抑制作用。

DIP激活I型干扰素通路，保护小鼠免受病毒性肺炎的侵袭

已发表的临床研究都提示DIP的光谱抗病毒作用。我们的实验结果验证这一结论。在单链RNA病毒（仙台病毒SeV和水疱型口膜炎病毒VSV）刺激的A549细胞中， DIP（5μM）处理IFNB、IFIT1 mRNA水平升高。poly（I:C）刺激可模拟广谱RNA病毒感染，DIP给药剂量依赖性地促进IFNB、ISG15和IFIT1 mRNA的表达。在DIP的作用下A549细胞产生的IFN-β显著增加。在SeV刺激感染的293T细胞中，DIP可以显著升高TBK1和IRF3磷酸化水平，提示DIP促进I型干扰素通路的激活。

为了验证DIP在体内的抗病毒作用，我们建立了VSV病毒诱导的肺炎模型。DIP给药组VSV感染小鼠的存活率明显升高，病毒感染导致的肺组织结构的破坏和肺泡炎症减轻。这些结果提示治疗剂量的DIP可激发有效的广谱抗单链RNA病毒免疫反应，抑制病毒感染所致的组织损伤。

DIP辅助治疗显著改善COVID-19患者的凝血功能

为了评估COVID-19患者凝血状况，我们回顾性分析了124名COVID-19患者的队列（补充表格1），发现其中25例（20.2%）患者血小板计数下降，77例（62.1%）患者凝血酶原时间（PT）延长，27例（21.8%）患者纤维蛋白原（FIB）水平升高，以及 26例（21.0%）患者D-二聚体水平升高。这些数据表明COVID-19患者中凝血功能异常是常见的血液表现。

共有22名患者纳入此次临床试验，包括10名对照受试者和12名接受DIP辅助治疗的患者。两组患者基础临床症状相似（表1）。DIP组和对照组的患者，平均年龄分别为53岁和58岁。所有患者均表现为咳嗽，大多数患者感到呼吸急促，60.0%患者伴有恶心和呕吐症状，胸部CT扫描显示患者均为双侧肺炎。DIP组中有4例和对照组种有5例患者有合并症（糖尿病、心力衰竭和脑血管病）。所有患者均接受抗病毒、糖皮质激素和氧疗，没有采取抗真菌治疗，其他治疗包括机械通气（DIP组16.7%，对照组10.0%）、抗生素（33.3%，30.0%）和静脉注射免疫球蛋白（16.7%，20.0%）。

经DIP辅助治疗两周后，6例重症中的3例（50%）以及全4例轻症（100%）患者出院。1例危重症患者入院时就有极高的D-二聚体水平和极低的淋巴细胞数，在加入DIP辅助治疗治疗后也没能挽救生命。其他的几例患者都正在恢复中。与DIP组相比，在对照组的轻重度患者的治愈出院率均要低于DIP组（表2）。

加入DIP进行辅助治疗之前，DIP组患者的基础体温高于对照组，氧合状况也低于对照组，但经过一天的治疗两者的温度和氧合情况都稳定下来。我们观察到，与对照组相比，DIP组淋巴细胞和血小板计数均呈增加趋势。淋巴细胞减少和血小板减少常伴随/导致重症和危重症的发生，DIP有效的帮助病毒感染的机体恢复免疫力，阻止病情向重症以及危重症发展。

值得注意的是， DIP组的4名患者和对照组的2名患者在入院时就具有较高的D-二聚体水平（表1）。通过监测患者的D-二聚体水平的动态变化，我们发现对照组的D-二聚体水平呈持续上升状态，而DIP组D-二聚体水平稳步降低并稳定在较低水平。

我们对2名危重症患者使用了DIP辅助治疗，其中一名在入院时血氧饱和度非常低，并伴有缺氧和多器官功能衰竭的70岁男性患者死亡。在加入DIP治疗前，这名患者的D-二聚体水平极高（16.2μg/mL）和淋巴细胞数（0.37X109/L）也已将至很低。由于他的血氧饱和度持续很低，在接受DIP治疗的第5天去世。另外一名危重症患者在DIP加入治疗前也有很低的氧饱和度和较高的D-二聚体水平（8.83μg/mL），D-二聚体水平曾一度高达15.72μg/mL。在接受DIP辅助治疗后，D-二聚体水平逐步下降到3.69μg/mL，血氧饱和度也在提高，患者由危重症进入康复阶段。这些临床发现也提示了高D-二聚体水平和低淋巴细胞计数与预后不良有关，并表明在疾病进展到危重症之前就应开始进行DIP治疗。

所有患者在治疗前都进行了胸部CT扫描，结果显示为典型的多片状磨玻璃样影。在DIP治疗的患者中，肺部浸润有明显的吸收。下图展示了1例重症患者在DIP治疗后的一系列的肺部CT扫描。

图.治疗前后胸部CT图像的轴向视图（左图）和冠状视图（右图）

（A）初次胸部CT扫描，DIP治疗前10天。（B）胸部CT扫描，DIP治疗前5天。（C）胸部CT扫描，DIP治疗前2天。（D）胸部CT扫描，DIP治疗2天后。（E）胸片CT扫描，DIP治疗7天后。

讨论

HCoV-19给人类的健康造成巨大的威胁，目前还没有任何药物被有效应用于抗病毒治疗。相比SARS-CoV-感染，我们提出假设：HCoV-19的Spike蛋白可能激活肺中的肾素-血管紧张素系统（RAS）。该假说得到了已发表的COVID-19患者的临床特征和生化指标的支持，包括ARDS、高血压、急性心脏、肾损伤和D-二聚体阳性结果。在寻找有效的抗凝血剂时，我们专注于DIP，因为它具有广谱的抗病毒、抗炎和抗纤维化作用。我们证实DIP在体外和在VSV诱导的病毒性肺炎模型中对单链RNA病毒具有较强的抗病毒能力。最重要的是DIP对HCov-19病毒复制的EC50低至0.1μM，这意味着在人体中这个剂量的DIP就可以在感染的人体中发挥治疗作用。的确，在临床治疗中，治疗14天后，12个患者中有7名已经出院，4名症状减轻，进入康复阶段。

我们发现，如果DIP辅助治疗在早期应用于COVID-19重症患者，能有效的预防血液高凝状态。DIP治疗降低了D-二聚体水平，增加了外周循环中血小板数和白细胞数，从而促进临床治愈和症状缓解。D-二聚体水平是一个重要的预后因素，密切反映肺栓塞、血管血栓形成和肾功能不全，决定了ICU患者是否可以从重症感染中恢复。DIP的抗病毒、抗炎及抗高凝作用，可降低HCoV-19感染患者形成微血管血栓的风险。DIP还可以改善血管循环，恢复心脏和肾脏等重要器官的主要功能。

总之，我们建议对早期有D-二聚体水平升高迹象的COVID-19患者进行抗凝治疗。DIP作为抗血小板药物，临床应用安全。此外，作为泛PDE抑制剂，DIP激活广谱抗病毒免疫，以及在抗炎和抗纤维化方面也起了重要作用。此外，DIP实用、价格低廉，节约研发时间和医疗成本。在疫情迅速扩散到其他发展中国家的情况下，应当继续探索研究DIP对COVID-19患者的治疗作用。

原文链接：

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.02.27.20027557v1

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