导言
液体活检（liquid biopsy）可以通过测定体液（例如血液）中的某些指标来推断人是否可能有某种疾病（例如癌症）。这一领域近年来面临着前所未有的巨大机遇与挑战。一方面，人们越来越清楚的认识到体液中蕴含的疾病的“密码”；另一方面，受技术手段的限制，从体液中捕获测定这些重要的密码，无异于大海捞针。今天的《自然·生物医学工程》期刊在线刊登了国家纳米科学中心孙佳姝团队开发的最新技术平台。基于这一平台，他们构建了一套简单而廉价的液体活检癌症筛查方法：只需少量血清（1微升，通常采血管采血量的1/5000），检测其中的细胞外囊泡，就可以在20分钟内对6种癌症进行早期筛查，并区分不同的癌症类型。我们今天就来解读一下这一平台是如何工作的。非常幸运的是，我们也采访到了本文的第一作者，他对本文进行了技术把关和问题解答。
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液体活检的蓝天与乌云
活检是许多疾病（例如癌症）的诊断金标准。传统意义上的活检，人们需要通过切取或穿刺等手段将疑似病变组织取出，然后对它进行病理分析。这一手段虽然大多数情况下可以较好地反映疾病的真实状态，但也会由于取样手段的限制导致漏检误诊。并且，取材的过程往往需要手术，给病人带来痛苦和更高的医疗成本。
液体活检则与传统的穿刺活检不同。通常情况下，人们只需要取出某种体液（例如血液），并对其中的某些成分（如循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和外泌体）进行分析，即可对疾病做出诊断。液体活检明显比穿刺活检更加简单易行，对患者造成的创伤也更小。在过去，某些特定肿瘤的血液标志物已经成为体检或医院常规的筛查手段。人们也一直畅想着在未来，医院只需要取出一滴血，就可以看到所有的致病特征。业界也看到了这一领域的广阔空间，对相关领域寄予厚望。
图1 传统活检与液体活检对比[1]
然而，高效液体活检的实现，却并不简单。首先，人们必须找到血液中或体液中某种标志物与疾病的关系。其次，这些待检测物质与体液中繁杂的细胞，蛋白，各类因子相比，往往含量是沧海一粟。实际的测定过程，如大海捞针一般。
巨大的前景与巨大的挑战并存下，科学家，商业公司和投资人都没有停止自己的脚步。然而今年5月，一本名为《Bad Blood》的畅销书将这一领域内绝对的明星公司推下神坛：价值10亿美元的Theranos，原来是造假的。他们所谓的一滴血测多种癌，根本就没有办法实现。“滴血验癌”和“液体活检”，也从“行业风口”变为“爆出造假的雷区”。这一事件也成为一朵乌云，笼罩了整个领域。
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EV+热泳+核酸适配体
但终究，大雨只能洗去表面的浮尘，却带不走有着扎实根基的磐石。北京时间，1月21日，国家纳米科学中心孙佳姝团队在顶级学术期刊《自然生物医学工程》在线发表论文[2]，展示了他们的技术平台，在滴血验癌的领域取得了重要突破：使用1微升（通常采血管采血量的1/5000）血清中细胞外囊泡的膜蛋白表达状况，在20分钟以内能够对六种癌症进行早期筛查与分类。
细胞外囊泡（Extracellularvesicles, EV）是人体细胞（包括肿瘤细胞在内）分泌到胞外环境的具有膜结构的囊泡，直径在30– 1000 nm之间。以往研究发现EV携带了母细胞的多种蛋白质、核酸和磷脂等重要分子信息。癌细胞与正常细胞所分泌的EV呈现出不同膜蛋白特征，而这些特征差异就可以用于癌症的筛查与诊断。细胞外囊泡作为液体活检标志物中的后起之秀，相对于循环肿瘤细胞与循环肿瘤DNA，在血液中的含量丰富，其分析不需要采集大量血液。此外由于膜结构的保护，外泌体膜蛋白在长期冷存的血液中依然能够被分离和检测出来。
然而，将EV分析检测广泛应用于临床并不容易。通常人们需要长时间的超速离心从血液中提取EV，而且容易受到共沉淀的杂蛋白的影响。而后续膜蛋白分析手段如酶联免疫吸附实验、蛋白免疫印迹和质谱，需要专业技术人员操作，过程复杂繁琐，成本高耗时长。因而，迫切需要一种更加简单、快速、廉价的EV分析检测手段。
热泳与核酸适配体巧妙地结合提供了绝佳的解决方案。
核酸适配体（Aptamer）是一种经体外筛得到的结构化的寡核苷酸序列(RNA或 DNA)，能够像抗体一样，对相应的靶标分子有很强的识别能力和高度的亲和力。（点击阅读原文，了解更多关于核酸适配体的信息）核酸适配体尺寸只有2 – 3 nm，能够充分识别EV表面有限的空间内分布的膜蛋白。首先，研究人员将0.1 μL的血清样品进行稀释，然后加入了具有识别特定癌症相关膜蛋白的荧光核酸适配体。这样一来，带有荧光的核酸适配体就会结合到携带这种膜蛋白的EV上，把癌症的信息标记出来。此时，由于所有的EV在溶液中都是分散存在的，荧光也处于均匀分散的状态，荧光值较低无法被读出。但罪恶的肿瘤信息，已经被核酸适配体打上了印记。
图2 核酸适配体标记EV
接下来，科研人员使用了一种叫做热泳的技术实现荧光信号的放大读出。热泳是颗粒在温度梯度内的定向运动，是一种能够有效操控纳米尺度物体的有效机制。通过一束非常细的激光照射溶液中的局部，照射部位产生极强的温度梯度使EV定向游动到照射点下方温度较低的区域。同时样本液体局部受热膨胀产生对流，与热泳合伙，快速地将大范围区域内EV聚集在照射点。在短暂的激光照射后，起初分散的被标记荧光的EV就会在照射点聚集上千倍，就可以被仪器清晰地识别。荧光亮度的强弱就直接反映了膜蛋白的表达高低。这种方法的妙处还在于无需复杂的EV分离提纯而直接检测：如果某个单独的核酸适配体分子没有标记在EV，由于其尺寸较小，是不会被汇聚在成像点上的；如果某个EV分子跟肿瘤无关，那么他就没有被标记应该，即使被汇聚，也不会被仪器读出来；所有的亮点都是被标记的肿瘤相关EV。
图3 热泳的实现方法
图4 针对EV尺寸范围（30-1000 nm）的热泳信号放大
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机器学习助力癌症区分
接着，科研人员研究了EV膜蛋白检测对癌症诊断的能力。他们取了60份癌症患者（6种癌症：乳腺癌、肝癌、肺癌、淋巴癌、卵巢癌与前列腺癌各10份）与10份健康对照的血清样本，对每份样本进行7种抗原多靶标检测，用检测结果训练机器学习分类算法。在训练中发现对癌症检测的灵敏度与特异性都接近100%，曲线下面积达到1.000！
为了验证这一平台的实用性，研究人员又进一步对102份病人（以上6种癌症，I–IV期）的血液样本进行单盲检测：同样达到了接近100%的灵敏度与特异性。并且，即使是对I期癌症这种早期的情况，这一系统的检测的灵敏度仍旧达到95%以上！对这六种癌症进行分类的准确率也达到了68%。
图5 基于7抗原体系的交叉检测分析技术
尤其值得一提的是，通过检测前列腺穿刺患者血清样本中EV膜蛋白表达，能够有效区分前列癌与其他良性增生，曲线下面积达到0.94。相比之下，当前临床常用标志物PSA的检测只有0.68。这一基于EV膜蛋白的液体活检技术，相比于当前临床确诊前列腺癌的手段而言，具有更低假阳性率、无创、监测术后复发等优势。绝对可以说是目前液体活检领域的重大突破。
图6 TAS 区分不同肿瘤阶段与分类
图7 TAS 区分前列腺癌与良性病变
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作者专访
幸运的是，我们采访到了本文的第一作者，他热心的解答了我们的疑问。
问：EV在临床中可能还有哪些应用呢？
答：基于EV携带标志物的检测，除了可以用于癌症的筛查与复发监控，还可应用于治疗方案评价、预后以及靶向给药成像方面。
问：EV是所有肿瘤都存在的现象吗？
答：几乎所有的哺乳动物细胞都会分泌EV，理论上所有肿瘤都会产生EV。
问：只取那么少体积的血液，会不会影响到检测的重复性？
答：EV在血液中的数量极多，1微升血液中约有100,000–1,000,000个EV，足够产生具有统计意义的结果。研究结果显示测量的批次间差异小于25%。
问：用热用富集EV是根据尺寸吗? 如何做到高特异性呢?会不会有类似大小的颗粒存在血液里面。
答：通过优化样本室尺寸与底部导热材料，热泳可选择性富集直径30–1000 nm的颗粒，涵盖EV的尺寸范围。血液中的低密度脂蛋白与乳糜蛋白的尺寸也会落入这个区间，但无法被荧光核酸适配体标记，对检测不产生影响。
问：目前这一体系还有哪些比较难以解决的问题？
答：EV的膜内蛋白与核酸的检测，以及多抗原的同时检测。
问：这一平台是如何从课题组内研发出来的？
答：自2011年，加入国家纳米中心以来，我们就在微流控颗粒分离、操纵和分析检测领域开发了多项前沿技术。可以说，我们多年的技术积累对于最终实现EV分离起到了重要的作用。同时，我们受到了来自谭蔚泓院士（核酸适配体专家），生物学家，临床医学专家大力支持与广泛的建议。最终促使我们的技术平台向癌症筛查的成功转型。
问：之后平台的发展方向是什么？
答：发展EV膜内蛋白与核酸的检测方法，使之成为通用的EV检测平台。
参考文献：
[1] https://www.genengnews.com/topics/translational-medicine/liquid-biopsy-predicts-colon-cancer-recurrence/81252922/
[2] DOI:10.1038/s41551-018-0343-6.
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