文/ Echo  徐

编/Ginger
随着CAR-T/TCR-T疗法在肿瘤领域大获成功（更多信息请参考美柏医健产业图谱https://www.mybiogate.com/industrymap），过继性免疫细胞治疗受到了监管机构、研究机构、生物技术公司、制药巨头的空前关注。纵观整个免疫系统，以T细胞为基础的免疫疗法具有两大独特优势，一是一旦接触过“敌人”，T细胞具有“过目不忘”的能力，能够记住敌人，再度攻击，提供持久的保护；二是其对“敌人”的识别有特异性，因此可以通过“特殊手段”将T细胞导向肿瘤细胞。
与T细胞同样具有杀伤作用的还有两大类细胞，一是巨噬细胞，可以吞噬外来敌人，将其“肢解”后呈递给T细胞；二是自然杀伤细胞(NK细胞)，可通过释放细胞因子杀伤细胞。虽然巨噬细胞、NK细胞对肿瘤细胞的杀伤不具有特异性，也没有传统意义上的“记忆功能”，但随着生物技术的迅猛发展，各大企业集思广益，各显神通，尝试赋予这两大类细胞T细胞所具有的“超能力”。现在就快快来带领读者们看看这些生物技术公司的神秘武器。
以巨噬细胞为基础的肿瘤免疫疗法
直接靶向肿瘤巨噬细胞
肿瘤中数量最多的免疫细胞非巨噬细胞莫属了，然而，这些正常情况下的免疫斗士却为肿瘤所用，与肿瘤细胞沆瀣一气，帮助肿瘤血管生成、转移、耐药，营造出抑制性肿瘤微环境。因此，自然而然地，以巨噬细胞为基础的免疫疗法旨在特异性清除这些已与肿瘤细胞同流合污的巨噬细胞。
Macrophage Pharma是一家英国的肿瘤免疫公司，成立于2014年，2017年获£9M的A轮融资，其参投机构包括CRT Pioneer Fund、Novo Seeds、Aglaia、Merck Ventures。Macrophage Pharma开发的Esterase Sensitive MotifTM（ESM）技术平台，旨在选择性地杀伤为“肿瘤君”所用的巨噬细胞，为T细胞等免疫细胞发挥作用开疆拓土。
那么ESM是怎样选择性地杀伤巨噬细胞的呢？原来，Macrophage Pharma利用了“前药（prodrug）”的概念。他们通过化学方法，将一系列药物，如HDAC、p38 MAPK、Hsp90、IkB-2激酶抑制剂等与氨基酸成酯做成前药，这些前药在血浆中稳定存在，但是在人羧酸酯酶-1的作用下，酯键被水解，前药变成原药而发挥作用。目前，Macrophage Pharma主推的项目为p38 MAPK ESM。抑制巨噬细胞p38 MAPK可以逆转抑制性微环境，促进巨噬细胞释放IL12恢复T细胞功能，此外抑制抑制性抗原呈递细胞的p38 MAPK还可以提高其抗原呈递功能。
2018年AACR年会上，Macrophage Pharma汇报了其ESMTM p38 MAPK抑制剂（MPL-5821）的最新研究进展。功能正常的巨噬细胞在TLR激动剂的作用下会释放IL-12p70，TLR激动剂LPS同时促进抑制性细胞因子IL10的产生而限制了其在肿瘤免疫治疗中的应用。 Macrophage Pharma的研究对比了MPL-5821与多种非靶向药物包括HDAC、JAK、PI3K、MEK、CSF-1R抑制剂对人外周血中巨噬细胞功能的影响，研究结果表明，只有MPL-5821能够在抑制LPS诱导的IL10产生的同时，促进淋巴细胞IFNg的生成。
▲ 图片来源：http://www.macrophagepharma.com/science-technology/esm-technology/
2015年Navidea Biopharmaceuticals子公司Macrophage Therapeutics成立，同年获$2.5M的种子融资。与Macrophage Pharma不同，Macrophage Therapeutics拥有Manocept技术平台，可改造已有FDA批准上市的药物，使其能够特异性、高亲和地结合巨噬细胞表面的甘露糖受体CD206，靶向杀伤肿瘤中的巨噬细胞。目前，其拥有两大产品管线，MT-1001与MT-2001。MT-1001包含多柔比星，一种抗肿瘤抗生素。MT-2001则以Lymphoseek为基础。Lymphoseek（含放射性元素Tc 99m）是首个也是唯一一个FDA批准的靶向甘露糖受体的淋巴标记制剂，可以精准地标记肿瘤引流淋巴结（draining lymph nodes）。
CAR-Macrophage
如果说Macrophage Pharma与Macrophage Therapeutics都是循规蹈矩，按照套路出牌的“乖学生”，那么下面这家公司绝对可以称得上不走寻常路、以巨噬细胞为基础的肿瘤免疫界的“闹海哪吒”了。Carisma Therapeutics于2016年成立，在CAR-T研究如日中天的时候，大胆地提出了“CAR-Macrophage”的概念。众所周知，肿瘤细胞中的免疫细胞绝大多数都是巨噬细胞，但是这些巨噬细胞都已经沦为肿瘤细胞的“阶下囚”，在人们想着如何除掉这些坏家伙的同时，Carisma想的却是要策反这些“阶下囚”。
▲ 图片来源：http://carismatx.com/
CAR-Macrophage技术平台由宾夕法尼亚大学Saar Gill、Michael Klichinsky博士开发，CAR-T领域大名鼎鼎的Carl June是Carisma的科学顾问委员会之一。目前公司只有五个人，他们计划在未来一年里雇佣新的CSO、CMO以及20个FTE。2018年6月，Carisma Therapeutics获得Abbvie Ventures、HealthCap、Wellington Partners、TPG Biotech、MRL Ventures Fund、Agent Capital共计 $53M 的A轮融资，计划在2019年将CAR-Macrophage推进至人体试验阶段。
由于实体瘤拥有强大的抑制性微环境，使得CAR-T对实体瘤治疗效果微弱。与T细胞相比，Macrophage对氧气和营养要求更低，是实体肿瘤中数目最多的免疫细胞，若能成功“策反”这些巨噬细胞，其将成为杀伤肿瘤细胞的利器。与CAR-T的概念相似，Carisma Therapeutics计划从肿瘤患者身上提取巨噬细胞，通过基因工程的方法，使其表达能够特异性识别肿瘤抗原的CAR，巨噬细胞识别、杀伤、吞噬肿瘤细胞，将肿瘤抗原呈递给T细胞，激活T细胞，实现肿瘤杀伤。 
理想总是丰满，那么CAR-Macrophage的概念究竟能否成为现实呢？2017年AACR年会上，Carisma报告了CAR-Macrophage的最新研究成果（Abstract 4575）。通过基因改造的方法，使THP1巨噬细胞表达靶向CD19、mesothelin、HER2的CAR（包含CD3ζ细胞内结构域），称CARMA细胞。体外实验结果表明，CARMA选择性地吞噬、清除了表达相应抗原的肿瘤细胞。不包含CD3ζ细胞内结构域的CARMA吞噬和杀伤能力骤减，表明CD3ζ介导的胞内信号转导的重要性。此外，CARMA提高了CD8 T细胞的增殖能力。体内实验方面，在卵巢癌细胞系SKOV3肿瘤小鼠模型中，与对照相比，Anti-HER2 CARMA显著减缓肿瘤生长，将小鼠生存期延长了30天。在SKOV3肿瘤转移模型中，单一剂量的Anti-HER2 CARMA静脉注射产生了持续的抗肿瘤作用，是对照组的38倍。
CARMA在人体试验中表现如何呢，我们将拭目以待。
以NK细胞为基础的肿瘤免疫疗法
Fc优化的单克隆抗体
NK细胞杀伤肿瘤细胞的一大机制是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity，ADCC）。如图所示，单克隆抗体的Fab端识别并结合肿瘤细胞表面的特异性抗原，其Fc端与NK细胞表面的CD16结合，可激活NK细胞，杀伤肿瘤细胞。单抗的抗肿瘤作用一大功臣便是NK细胞与ADCC作用，如何提高抗体Fc端介导的NK细胞激活成为一大研究热点。
▲ 图片来源：http://www.stream.wum.edu.pl/en/knowledge-base/96-nk-cells-applications-in-immuno-oncology
Kyowa Hakko Kirin靶向CCR4的单抗产品Mogamulizumab（KW-0761）是Fc端优化的典范，该抗体的Fc端做了非岩藻糖化（afucosylated），2012年在日本获批用于复发性、难治性CCR4+的成人T细胞白血病／淋巴癌的治疗，2014年获批用于CCR4+的皮肤T细胞淋巴癌。2017年11月，Mogamulizumab在皮肤T细胞淋巴癌中的治疗获得美国FDA优先审批的特权。目前，Mogamulizumab具有多项临床试验，适应症包括皮肤T细胞淋巴癌、成人T细胞白血病及多种实体瘤等等，其在皮肤T细胞淋巴癌中的研究已经进展至3期，或成为同类产品中首个上市的产品。
▲ 图片来源：http://www.kyowa-kirin.com/research_and_development/pipeline/index.html
GlycArt Biotechnology AG最初是由ETH Zurich大学成立的初创公司，首轮融资由Glide领投。2005年，Roche从Glide收购GlycArt。最初由GlycArt发明，后经Roche Genentech开发，靶向CD20的单抗Obinutuzumab（Gazyva），Fc端做了低岩藻糖（low-fucose）化优化，2013年被Obinutuzumab美国FDA批准上市，用于慢性淋巴细胞白血病的治疗。Mentrik Biotech靶向CD20的单抗产品Ocaratuzumab（AME-133v）用于滤泡性淋巴癌的治疗已经进展至临床3期。
Roche GlycArt靶向EGFR、Fc端优化的单抗产品Imgatuzumab，目前正处于1/2期试验阶段，用于治疗头颈癌及KRAS突变的结肠癌。
双特异性抗体
过去十年中，用于肿瘤免疫治疗的双、三特异性抗体发展迅速。顾名思义，双特异性抗体利用抗体Fab端具有两个特异性识别位点的特点，将免疫细胞和肿瘤细胞连结起来。截至目前，多数的双特异性抗体靶向T细胞，只有极少数的双特异性抗体靶向NK细胞。
Affimed公司具有独家平台ROCK™，可以生产“四键”抗体，其中两个位点识别免疫细胞，两个位点识别肿瘤细胞，将免疫T细胞或NK细胞导向肿瘤细胞。目前，Affimed的AFM13同时靶向肿瘤细胞表面的CD30和NK细胞表面的CD16a，其在霍奇金氏淋巴瘤中的研究处于临床2期阶段。在1期试验中，AFM13耐受良好，总体响应率为26%，同时，AFM13提高了NK细胞活性，降低了外周血中可溶性CD30的水平（NCT01221571）。
AFM22、AFM24同时靶向肿瘤细胞表面的EGFRvIII和NK细胞表面的CD16a，处于临床前研究阶段，用于治疗EGFRvIII阳性的实体瘤包括胶质母细胞瘤等。
▲ 图片来源：http://www.affimed.com/products.php
与T细胞相似，NK细胞表面也存在着“油门”与“刹车”系统，激活性受体与抑制性受体与其相应配体之间的相互作用可以调节NK细胞活性。NKG2D是NK细胞表面的激活性受体，其与配体的结合能够激活NK细胞。肿瘤细胞往往通过下调或脱落NKG2D的配体MICA来避免NK细胞的激活。
通过蛋白工程的手段，AvidBiotics公司的XYPHOS convertibleCAR技术平台将NKG2D进行突变，使其不再结合自然配体，而变成惰性NKG2D受体（inert NKG2D，iNKG2D）。同时，生产突变的NKG2D配体，不再结合自然NKG2D受体，而是特异性结合惰性NKG2D受体，再将该突变配体与能够识别肿瘤细胞表面特异性抗原的抗体融合（称为MicAbody），如此一来，通过向患者体内输入一定剂量的MicAbody，能够选择性地连结肿瘤细胞和表达惰性NKG2D的NK细胞，激活NK细胞，导致肿瘤细胞的杀伤。该系统最大的优点在于，可以选择性、剂量依赖性地激活NK细胞，同时，由于这些NK细胞表达突变的惰性NKG2D受体，不结合自然配体而最大限度地避免了毒性反应。
▲ 图片来源：https://xyphosinc.com/technology/convertiblecar/
NKp46是NK细胞表面的激活性受体，是人NK细胞表面特异性最高的受体。Innate Pharma开发了连结NK细胞表面NKp46及肿瘤细胞表面特异性抗原的双特异性抗体。该项目由欧盟通过欧洲区域发展基金支持。Innate Pharma和Sanofi达成了合作共识，Sanofi可以参与Innate Pharma两个双特异性抗体的研究和开发，Sanofi负责开发、生产和商业化，而在开发和商业化的过程中，Innate Pharma可以获取高达€400M的里程碑付费。
▲图片来源：https://www.innate-pharma.com/en/pipeline/bispecific-antibodies-technology-nk-cells-engagers
NK细胞免疫检查点抑制剂
那么，除了利用双特异性抗体为NK细胞“踩油门”之外，聪明的科学家还要为NK细胞“松刹车”，那就是抑制NK细胞表面的抑制性受体。Innate Pharma在该研究领域占据绝对领先地位。其明星产品Lirilumab（IPH2102/BMS 986015）是一种完全人源化的IgG4抗KIR抗体，靶向抑制性KIR受体KIR2DL1/2/3。Innate Pharma就Lirilumab与BMS达成高达$465的战略合作。靶向KIR3DL2的单抗IPH4102也已经进入临床研究阶段。关于Innate Pharma靶向KIR的产品及其临床表现分析请参见ASCO 2018 摘要靶点深度解读专题——KIR。
CAR-NK
NK细胞对肿瘤细胞的识别没有特异性，通过使用嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptors，CAR），可谓给NK细胞提供了一盏“指路灯”，可以实现免疫细胞对肿瘤细胞的特异性识别。
NantKwest的明星产品NK-92，是一种永生化的NK细胞系，其表面缺乏抑制性受体，处于随时可以被激活的状态（activated Natural Killer Cell，aNK）具有强大的肿瘤杀伤作用。基于NK-92衍生出了两个姊妹产品，haNK及taNK。haNK在NK-92细胞表面表达高亲和力、可以结合抗体Fc端的CD16，以提高NK细胞的ADCC作用（见上文）。taNK则在NK-92细胞表面表达可以靶向特异性肿瘤抗原的CAR。靶向神经母细胞瘤GD2，黑色素瘤GPA7，乳腺癌EpCAM、HER-2、EGFR，多发性骨髓瘤CS1、CD138，白血病CD19、CD20的taNK细胞均在研究中。NantKwest与Sorrento Therapeutics达成合作协议，开发靶向PD-L1以及ROR-1的NK-92 CAR。
▲ 图片来源：NantKwest官网
通过小分子提高NK细胞存活与功能
Fate Therapeutics旨在提高NK细胞的功能，其拥有两大NK细胞管线，其一是通过特殊的培养方法方法从健康人外周血获得具有强大杀伤、存活能力的“记忆”NK细胞。NK细胞为CD3-CD56＋的细胞，随着NK细胞成熟，其表达CD57，释放细胞因子、通过ADCC作用杀伤肿瘤细胞的能力更强，称“记忆”NK细胞。Fate Therapeutics将健康人外周血中的CD3+ T细胞以及CD19+ B细胞除去，将剩余的成分与IL15、GSK3β的小分子抑制剂共同培养7天，如此获得的NK细胞称为Fate-NK100。与空白对照相比，GSK3β的小分子抑制剂显著提高了CD57+ NK细胞的比率（2.2-fold ± 0.19, n=23, p<0.0001）。
▲ 图片来源：http://fatetherapeutics.com/pipeline/immuno-oncology-candidates/fate-nk100/
▲ 图片来源：http://fatetherapeutics.com/pipeline/
Fate-NK100在临床试验中的表现不俗。1期试验Voyage（NCT03081780
）由Masonic Cancer Center和明尼苏达大学共同发起，将Fate-NK100用于难治性或复发性AML的治疗。2017年11月，Voyage试验的结果在Society for Immunotherapy of Cancer Annual Meeting汇报。在一级剂量中一位患者达到50%肿瘤缓解，二级剂量中，通过骨髓活检，一位患者实现肿瘤清除。2017年10月，1期试验（NCT03213964）APOLLO将Fate-NK100通过腹腔注射的方式给予患晚期卵巢癌、输卵管癌、腹腔癌的女性，Fate Therapeutics旨在通过该试验评估通过腹腔注射的形式给予的Fate-NK100在患者体内的存活能力和抗肿瘤活性。2018年3月，公司表示该试验已经达到二级剂量，未见剂量限制毒性。2018年1月开始的1期试验DIMENSION（NCT03319459），将Fate-NK100与靶向HER2的单抗trastuzumab以及靶向EGFR的单抗cetuximab联同，用于多种肿瘤的治疗，以期通过提高ADCC作用，增强NK细胞的肿瘤杀伤能力。
烟酰胺（Nicotinamide，NAM）是维生素B3的衍生物，是NAD依赖的酶的抑制剂。Gamida Cell在扩增NK细胞时，加入NAM，显著提高了NK细胞在体内的存活期，提高了归巢受体CD62L的表达，提高了在多种器官包括骨髓中的浸润。NAM还提高了NK细胞的杀伤能力以及释放免疫因子的能力。2017年10月，研究NAM-NK细胞在多种血液肿瘤中的作用的1期试验（NCT03019666）由Masonic Cancer Center和明尼苏达大学共同发起。
▲图片来源：https://www.gamida-cell.com/gamida-cell-pipeline-products/#namnk
热休克蛋白Hsp70在50-70%的肿瘤中呈阳性表达，Multimmune GmbH发展出了一系列以Hsp70为靶点的肿瘤免疫疗法，其中与NK细胞相关的包括：1）利用模拟Hsp70的合成多肽体外激活NK细胞（ENKASTIM-ev），目前已结束1期，进入2期试验；2）利用模拟Hsp70的合成多肽体内激活NK细胞（ENKASTIM-iv），目前仍处于临床前阶段。
▲ 图片来源：http://www.multimmune.de/mi-THERAPEUTICS-PIPELINE/
来自多能干细胞的NK细胞
Fate Therapeutics的另一NK细胞管线是从诱导多能干细胞（iPSC）分化出来，通过基因工程的方法使其表达具有高亲和力，无法脱落CD16 Fc受体的NK细胞（hnCD16-iNK）。该产品目前仍处于临床前研究阶段。在HER2+卵巢癌肿瘤模型中，与trastuzumab单用相比，与hnCD16-iNK联用提高了抗肿瘤活性。体外卵巢癌细胞系杀伤实验中，与从外周血或脐带血中获得的传统意义上的NK细胞相比，hnCD16-iNK提高了cetuximab的ADCC作用。与rituximab联用，hnCD16-iNK则剂量依赖性地提高了CD20+B细胞淋巴癌细胞系的杀伤作用。
▲ 图片来源：http://fatetherapeutics.com/pipeline/immuno-oncology-candidates/engineered-hncd16ink/

Glycostem开发了oNKord技术平台，从CD34+的脐带血中扩增、分化NK细胞，在临床1期试验中，分化得到的NK细胞以30X106细胞／千克体重的剂量输注给老年AML患者，安全性及有效性显著。输注的oNKord细胞成功抵达骨髓，并且在没有任何外加细胞因子的条件下发育成熟。
▲ 图片来源：http://glycostem.com/technology/natural-killer-cells
通过外加细胞因子提高NK细胞活性
为了提高NK细胞的抗肿瘤活性，一般会系统输注临床级的重组IL2（recombinant IL2，rIL2）或者单链IL15（single chain IL15，scIL15）细胞因子，然而，该疗法往往伴随严重的3/4级不良反应，而且，IL2输注往往同时导致抑制性免疫细胞Treg的扩增，抑制NK细胞的活性，因此，NK细胞临床试验多使用IL15。Nkarta Therapeutics通过基因工程的方法，使外周血NK细胞表达膜结合的IL15（memberane bound IL15，mbIL15）。mbIL15提高了NK细胞的存活、增殖、杀伤能力。
NK细胞较难在体外生长和扩增，CytoSen发明了特殊的NK细胞扩增、激活技术来解决这一难题。通过其技术平台，利用饲养细胞（feeder cell）或者纳米颗粒，可以获得对数级扩增的NK细胞，而且可以使用多种来源的NK细胞，包括外周血、脐带血、胎盘、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等。
与IL2相比，使用IL15激活NK细胞可以降低毛细血管渗漏综合征的发生，总体不良反应率低。然而，由于半衰期短、进入体内活性降低，哺乳动物重组IL15的使用在临床上受到限制。Altor BioScience开发了一种称为ALT-803的产品来克服这一难题。这种IL15超级激活剂由IL15突变体（IL-15N72D）与IL15受体α/IgG1 Fc融合而成。临床前实验表明，ALT-803可以同时提高NK细胞和T细胞的活性。一系列将ALT-803用于肿瘤、感染性疾病的临床试验正在进行中。
▲ 图片来源：http://www.altorbioscience.com/our-science/il-15-protein-superagonist-and-scaffold-technology/#ALT803
▲ 图片来源：http://www.altorbioscience.com/pipeline/
NK细胞的激活需要两大信号－Priming signal及Triggering signal，NK敏感的肿瘤细胞可以同时提供两种信号导致肿瘤清除，而NK耐受的肿瘤往往只能提供Triggering signal，此时需要额外提供Priming signal来激活NK细胞，这些Priming signal包括高剂量的IL2、IL15或者CNDO-109。Fortress Biotech选择了CNDO-109，与IL2和IL15相比，CNDO-109激活的NK细胞其活性在冻融之后仍得以保存，储存、运输都更加方便。CNDO-109-AANK的研究处于1/2期临床阶段（NCT01520558）。
▲ 图片来源：https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00631
结言
与巨噬细胞相比，以NK细胞为基础的免疫疗法在研项目更为全面，或将成为继T细胞之后，免疫细胞疗法的又一大赢家。以巨噬细胞和NK细胞为基础的肿瘤免疫疗法目前多处于临床前或临床1期研究阶段，其有效性的揭示仍然任重道远，然而，通过本篇文章，希望笔者传达出了一大讯息，那就是肿瘤免疫疗法时代已经全面来临，科学界将动用所有的智慧和资源，去唤醒肿瘤患者体内的免疫系统，用患者自身的能力与肿瘤君殊死一搏。
想了解更多肿瘤免疫疗法的前沿及技术突破，欢迎参加今年9月4-6日波士顿生物技术周“聚焦中国”论坛，参与和海外肿瘤免疫领域KOL的直接对话，对接可以引进中国市场的创新技术，拓展中国创新产品在海外的市场。
参考文献：
1. David Moffat,et al. MPL-5821, a macrophage targeted ESMTM?p38 MAPK inhibitor, inhibits the production of TLR agonist induced IL-10 whilst sparing T-cell functionality [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2018; 2018 Apr 14-18; Chicago, IL. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2018;78(13 Suppl):Abstract nr 3877.
2. Michael Klichinsky,et al. Chimeric antigen receptor macrophages (CARMA) for adoptive cellular immunotherapy of solid tumors [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2017; 2017 Apr 1-5; Washington, DC. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2017;77(13 Suppl):Abstract nr 4575. doi:10.1158/1538-7445.AM2017-4575.
3. SITC 2017 Abstract P167
4. John P. Veluchamy, et al. The Rise of Allogeneic Natural Killer Cells As a Platform for Cancer Immunotherapy: Recent Innovations and Future Developments. Front. Immunol., 31 May 2017.
本期作者：Echo 徐
北京大学药学院本硕，现约翰霍普金斯大学在读博士，研究免疫代谢、肿瘤免疫相关课题。
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