出门住个店，居然巧遇一个新物种！

今天，杨毅老师给我们带来了一个发现新物种的故事。2018年，在浙江长兴县，发现了长兴原指树蛙（Kurixalus inexpectatus），发现的过程颇为曲折，其中还夹杂着一些机缘巧合。

故事的缘起是南京林业大学生物与环境学院副教授Kevin Messenger想找角蟾亚科（Megophryinae）的最北新分布，而时任梨花女子大学博士后的Amaël Borzée想找依赖水稻田繁殖的无斑雨蛙（Dryophytes immaculatus）（想看这个物种的故事，你还可以读《寻找中国最后的无斑雨蛙！》）。

于是二人在2018年的4月底，到兼有丘陵（角蟾栖息地）和平原（雨蛙栖息地）的江浙两省交界地区联手考察，我作为Kevin的助理加入了考察队伍。结果无心插柳柳成荫，两位老师都未找到目标种，却在浙江省湖州市长兴县发现了一个新物种。

故事开始的地方

为了节约科研经费，我们的司机鹏常喜师傅找了一家度假村住宿，却意外把我们送到了树蛙新物种面前。

度假村坐落于湖州市西北郊一处丘陵东南缘，海拔不到100米的平缓山谷，一条溪水从深山竹林中淌出，穿越2千米度假村的范围后流入平原田野，滋养寻常百姓。我们都感慨这条溪水的清澈，形成水潭的地方甚至映出翡翠色。当时主打有机无公害的度假村对草坪、人工林地、菜地、茶园、桃园和荒地等均采用零农药。

山谷东北侧的山坡长着次生天然林，物种以茶（Camellia sinensis）、盐麸木（Rhus chinensis）、茅栗（Castanea seguinii）、山胡椒（Lindera glauca）、黄檀（Dalbergia hupeana）、木蜡树（Toxicodendron sylvestre）、白背叶（Mallotus apelta）、高粱藨（Rubus lambertianus）、竹（Bambusoideae）等为主，在以连片竹海为主导植被的该区域难得一见。当晚发现的长兴原指树蛙新种就在这片次生林山脚。

度假村内溪水潭及北侧山坡的次生杂树林，茶、盐麸木、茅栗、山胡椒、黄檀、木蜡树、白背叶、高粱藨、竹等构成群落，长兴原指树蛙就在篱笆外山脚的积水处繁殖 ©杨毅

夜探正片开始

白天视察过生境后，当晚下起温润的暮春小雨，正是蛙类出没的时节，Kevin、Amaël和我继续探索山谷。Kevin听到了陌生的动物鸣叫。Kevin自2006年起，几乎每年都来中国，脑海中积累了许多中国蛙鸣样本，但这回听到的声音令他毫无头绪，仅能凭直觉判定是蛙叫。

2018年4月26日记录下来的长兴原指树蛙鸣叫，Kevin在近百米外发现了它的声音 ©Kevin Messenger

于是Kevin叫上Amaël和我，沿着平行于溪水的土路向着声音源头寻觅，往上游方向走了百来米后踩着河床水浅裸露的部位过河，从对岸的铁丝围栏下钻了出去，来到一条土路上，窸窣的单音节口哨声就从土路对面的灌丛中发出。

杨毅老师画的地图，最初探测到长兴原指树蛙的地点，追溯鸣声源头的路线 ©杨毅

于是我们猫着腰找了半天，终于Kevin在离地面20厘米高的细枯枝上找到了发出声音的东西——一只褐色的，皮肤带有疣粒，体长仅3厘米的蛙。从它（手）指端和（脚）趾端膨大的吸盘，以及抓握攀援的行为，我们判断其属于树蛙科（Rhacophoridae）。

在低矮的枯枝上，我们终于找到了这只发出不明声音的蛙——第一只长兴原指树蛙 ©Kevin Messenger

接下来我们又找到了3只个体，尽管灰头土脸缺乏鉴别特征，Kevin和Amaël凭借经验推测其为原指树蛙属（Kurixalus）或棱皮树蛙属（Theloderma）的物种，而回去一翻图鉴对照形态便排除了后者，认定了是原指树蛙属。其实从行为上，我们也可以排除在积水树洞中繁殖的棱皮树蛙，因为此处的生境是山麓林缘的车轧印积水，所以应当是雄性原指树蛙在这里求偶鸣叫，吸引雌性前来交配并在水坑里或附近产卵，孵化后的蝌蚪在露天开放水体中发育至变态。

长兴原指树蛙繁殖生境，同时也是许多树蛙和其他蛙类物种共享的繁殖生境 ©BSGStudio、杨毅

几步之遥外，也利用林缘积水繁殖的大树蛙（Zhangixalus dennysi），将米黄色的卵粒产在一坨泡泡中悬于积水上方，这坨卵泡连同折断的树枝一起落水了，泡泡能防泼水但不耐受浸没，所以我们将其挂回了树上，不然卵会淹死 ©Amaël Borzée

就在这洼水和卵泡上方的梢头，我们找到了大树蛙本尊，很可能是它产下的卵 ©Amaël Borzée

不管是哪个属，它们都很像东南亚的物种，不像是会分布在北纬31°华东地区的物种。于是Amaël用棉签拭子采集了每只个体的唾液，准备以后用PCR（聚合酶链式反应）技术进行遗传物质鉴定，随后将蛙原地放归。

Amaël使用非侵害的采样方式，用拭子采集树蛙唾液用于分子鉴定，没有蛙愿意嘴里被插入棉签搅拌（但相信它们更不愿意被切除脚趾、大腿肌肉或肝脏），越小的蛙越难操作 ©Kevin Messenger

采集模式标本

为期3天的考察结束，坏消息是没有找到角蟾或雨蛙，好消息是分子鉴定结果显示我们发现的待定树蛙，与基因库里的任何物种都不吻合，与之亲缘关系最接近的是分布于中国台湾省的面天原指树蛙（Kurixalus idiootocus），即我们发现了原指树蛙属的一个新物种。

面天原指树蛙与我们在浙江北部发现的未知物种的遗传关系最为接近 ©庄铭丰

接下来，要发表并命名这一新物种，使之成为学术界“公认合法”的物种，就需要三件事：

第一，采集模式标本（type specimen），作为实物凭证供其他科学家参考和验证，以确保科研数据的准确性和可重复验证性。第二，对其形态学、遗传学等方面进行研究，并与已知的近缘种比较（差异）。第三，产出确凿数据后撰写描述新种的论文，投稿至领域适合的学术期刊，通过同行评审后接收发表。

分类学vs物理学模式，三个小鬼代表模式标本，其中最黑的是正模标本，模式标本正常要采不止一头，但正模必须有且只有一头，作为对该物种的直接定义 ©杨毅

鉴于人口稠密的长三角如果存在新种，那么它应当极度罕见或狭域，采集标本、杀死个体可能会对本就脆弱的种群造成危害。Amaël为了保护动物，希望用3D扫描技术代替传统的模式标本，来保存该种原指树蛙的形态特征。然而用这种技术来进行新种描述还太新颖，Amaël咨询了若干家学术期刊，均得到否定答复，所以为了让学术界承认该物种，我们只得按部就班地采集模式标本。

Scott Trageser用四台Sony RX0 II相机制作的，长吻斑蟾（Atelopus longirostris）的虚拟3D扫描影像，国际自然保护联盟（IUCN）一度将这种蛙列为灭绝，直到2016年在厄瓜多尔被重新发现 ©Scott Trageser

于是，在2018年7月4日，趁伏旱到来前，鹏师傅和我回到先前发现原指树蛙新种的地方，再次入住同一处度假村，目标是采集10只模式标本（最好包含雌雄及各生活史阶段的个体），录下鸣声［长得很像的动物，可能实际上并不是一个种，这种情况称为隐存种（cryptic species），叫声是一个很好的分辨方式］，记录生态习性，并尝试寻找周边潜在种群。

7月初的浙北处于梅雨末期，经过（一年中降水量最大的）6月的大量降雨，在原指树蛙栖息的山麓，积水早已高过了车辙印，彻底淹没了平缓的小路。

7月初的长兴原指树蛙模式产地（type locality）生境，积水淹没了小路，灌丛野蛮生长，听见和看见蛙的难度是两个级别 ©杨毅

我们白天在度假村对面的村民家吃饭，午后暴雨如注，村民得知我要晚上穿凉鞋找蛙，痛心疾首地劝说这里毒蛇多，得穿高筒靴。主人更是瞪得眼如铜铃，比划篮球粗的巨蟒，“爬行起来树叶沙沙作响，估计是百年蛇精”，在场者皆听得两股战战。我勉强忍住没笑。

当晚下着小雨，我在日落后沿度假村北边界围墙外的山麓土路走，树、草丛随处传来中国雨蛙（Hyla chinensis）清脆的呱声。我来到了一个很大的水洼前，沿路长达8米，深达15厘米以上，开始听到连绵不绝的急促口哨声，我相信它就是我要找的目标了。

次生林山麓土路最大的一处水洼 ©杨毅

2018年7月4日，我录下的长兴原指树蛙急促口哨般的鸣声，音频中还混杂小弧斑姬蛙（Microhyla heymonsi）拉链般的脉冲声和中国雨蛙的清脆呱声 ©杨毅

由于物理环境的变化（低温少雨vs高温多雨）以及潜在的种内雄性间竞争加剧，相比于4月底，7月初的原指树蛙叫得更活跃，数量更多。

2018年4月底（上）与7月初（下）长兴原指树蛙鸣声语图（纵轴表示频率，单位赫兹；横轴表示时间，单位秒；颜色表示信号强度）对比，后者单位时间内的音节数更多，注意前者包含两只个体的鸣声 ©杨毅

然而经过两个多月，植被也长得更为茂盛，尽管听到不少蛙叫，但透过灌木丛视觉搜寻的难度也大大增加。这蛙甚是警觉，被光照到便停止鸣叫甚至逃逸，好容易看到一只还得伸手去抓，人触动枝条或伸手接近蛙便受惊跳走。这片小树林遍布带刺的藤本植物高粱藨，没一会儿我的双臂就被划得火辣辣的，努力一晚上仅抓到6只活体。

第二晚我九点半才去采集，蛙鸣寥寥无几，我猜是因为树蛙的活跃高峰是黄昏或下小雨时，而现在天色已晚，雨也刚停。我尝试用引起蛙类发出鸣声惯用的playback方法，播放刚刚录到的叫声，期望雄蛙听到同类鸣声后为了保护资源（领地、配偶）发出鸣声作为（竞争性质的）回应，但收效甚微。

鸣叫求偶的雄性长兴原指树蛙，栖息在带刺植物高粱藨上是个反人类的好策略 ©杨毅

第三天黄昏再次大雨倾盆，接着减弱到小雨，尽管蛙鸣不如第一晚多，但顺利抓到了足够的蛙。我走完了度假村北边界的土路，一共发现至少五处原指树蛙主要的繁殖水坑，均是沿路最丰沛的几处水体。

经过三个晚上的努力，我一共采集到12只成年雄性个体。我将它们临时装在戳了透气孔的塑料瓶里，塞入潮湿的枯枝落叶，放进厕所，而不是开着空调的卧室，后者湿度会被空调降得过低，不利于蛙的生存。

我们也尝试搜寻长兴县和宜兴市周边潜在分布的种群，特别是寻找类似的林缘积水生境，但由于天气多雨和行程时间太紧，没有新发现，询问当地人哪里有这种生境或树蛙也没有得到结果。粗略考察江浙皖三省交界的森林，几乎是清一色的竹海，林下空旷，缺乏为原指树蛙提供栖息庇护的植被。

长兴县的竹林，林下空旷，缺乏能让原指树蛙栖息的灌丛 ©邓可

尽管Amaël相信江苏一侧也应当有该树蛙分布，但截止到我写作本文时，尚未听闻相关发现报道，只有中国科学院成都生物研究所的邓可博士在模式产地以西2千米处（相隔一条分水岭）的三个位点零星听到几只鸣叫，均位于竹林下有稀疏灌丛的地方。

后期研究与论文撰写

原指树蛙属不同的物种在形态和生态方面都比较近似，然而，同种的个体或在不同环境下却有明显可见的差异。也就是说种间差异不大，种内差异不小，所以它的分类相当困难。这种情况下，分子生物学能提供额外的遗传信息数据，重建物种之间的系统发育关系。现代分类学越来越多地采用整合的分类方法，将形态、分子、生态等多种信息结合起来，以获得更全面和准确的分类结果。

模式标本已经采集回屋，下一步要做的就是用游标卡尺对其进行形态测量。查阅以往所有原指树蛙属物种命名的文献，一共出现过18个形态指标，我们也测量本研究物种的18个形态指标。

蛙的形态指标示意图；A：头宽（HW）；B：头体长（SVL）；C：胫长（TL）；D：眼间距（IOD）；E：头长（HL）；F：眼径（ED）；G：鼻间距（IND）；H：眼鼻间距（EN）；I：足长（FL）；J：鼓膜径（TD）；K：股长（THL）；L：吻长（SL）；M：手长（HAL）；N：前臂长（FLL）；O：眼睑宽（UEW）；P：第3指吸盘宽（Fin3DW） ©Watters et al.

通常分类学家拍好青蛙新物种的生态照后，就会将其泡入70%酒精溶液定形制成标本，然后测量形态及取下肝脏或大腿肌肉做分子测序。但曾做过多年兽医，宠爱动物的Kevin不愿立即杀死蛙。他想保留活体饲养，直到树蛙寿终再做标本，这样没准还能观察到额外的生活史。

体型越小的蛙形态越难测，若活蹦乱跳则难上加难，所以Kevin准备了一瓶止痛药，嘱咐我滴一滴在蛙腹部，把它麻醉，趁其失去知觉的那段时间测形态。至于分子样品，按Amaël的嘱咐，每只个体用三根拭子先后采集三次唾液。

不料，麻醉后的蛙都没有苏醒，数小时后身体甚至发出臭味——一滴止痛药对这娇小的树蛙竟达到了致死量。Kevin吃惊，亲自控制剂量涂了不到一滴在下一只活的蛙腹部，这只幸运的蛙在昏倒后不久苏醒过来。Kevin曾用该方法麻醉过比原指树蛙体型大不了太多的角蟾。我们猜测，地栖物种普遍对化学污染耐受度相对高（尽管角蟾在地栖类群中算是对水质环境敏感的物种），而树栖物种皮肤更薄，更易吸收药剂，导致原指树蛙不幸丢了性命。

长兴原指树蛙同一个体深浅两种形态对比，不被打扰时为通常的深色形态，被人抓住后约半小时渐变为浅色 ©杨毅

给如此小的蛙做形态测量对我是个痛苦的过程，我努力找寻每个指标的边界并将测量爪与之相贴，每个个体的每个指标测三次取平均，确保数据准确，能为后人提供参考。

18个形态指标固然丰富，但其中许多变量间可能存在相关性，从而增加了数据分析的复杂性；如果单独分析每个指标，可能会忽略变量之间的相互关系和共同变化模式。这种情况下就需要用主成分分析（PCA）对数据降维，将相关性强的变量合并成尽可能少的新变量，最终只保留两个彼此正交的主成分。这样，数据便压缩到易于可视化和理解的二维空间中，同时保留了数据中最重要的信息。统计方法听上去高端复杂，实则都是机械套路的操作。

由 PCA 得出的两个主成分图，显示了长兴原指树蛙（绿色散点）与面天原指树蛙（蓝色散点）之间形态特征的非聚类 ©Kevin Messenger

长兴原指树蛙腹面胸口的两大块暗色斑也是一个形态鉴别特征 ©林青松

蛙的广告鸣叫（advertisement call）是一种种内通讯（intraspecific communication）方式，用于吸引配偶。每种蛙都会发出独特的鸣声，有助于形成交配前的生殖隔离（pre-mating reproductive isolation），从而促进物种的形成和维持。长兴原指树蛙的鸣声分析交由国立中兴大学的庄铭丰博士处理，他对中国台湾的几种原指树蛙具有丰富的研究经验，并保存有它们的鸣声录音。

庄铭丰要做的工作是，将本研究物种与它最近的“亲戚”面天原指树蛙的广告鸣叫属性进行比对。我们选择每回合鸣叫数（# of call in a bout）、回合时长（bout length）、音节间隔（call interval）、音节时长（call length）、主频（dominant frequency）等9个变量指标做种间比对，结果其中7个指标存在显著差异。主成分分析的结果也可看到明显的数据分离。

基因测序由梨花女子大学的研究生Siti Othman操作分析，结果显示长兴原指树蛙聚成一个单系，且与任何已知物种不构成单系，表明其有独特的遗传特征；它与分布于中国台湾省和琉球群岛的原指树蛙物种构成一个支系，而分布于东亚和东南亚大陆的大部分种类构成另一支系。

3.46百万年前的上新世，台湾省和大陆之间由一座陆桥相连，原指树蛙的祖先从华东南经该陆桥扩散到台湾省并定殖，然后在距今3.06百万年前的上新世晚期到更新世，长兴原指树蛙与跟它最近缘的，台湾省的面天原指树蛙发生分化，成为各自独立的物种。接下来的地质史里，地球经历了多次冰期和间冰期的交替，造成华东南地区的大部分原指树蛙灭绝，而江浙交界的长兴由于未知原因成了原指树蛙的避难所，使其成为了孑遗（relict）物种。

最后到了给新物种命名的环节。Kevin用inexpectatus作为这一新种的种加词，意为意料之外（unexpected）。当初想找角蟾和无斑雨蛙时意外地发现了它，在人口稠密的长三角找到未被发现的脊椎动物，而且是个热带类群，也是意外中的意外，从此将原指树蛙属的分布范围拓宽了663千米。

在学名命名中，种加词和属名如果都有性（别），应保持一致。原指树蛙属名Kurixalus以-us为后缀表阳性，所以种加词inexpectatus后缀与之对应也表阳性。

科研中充满了随机

不期而遇、采集标本、数据分析，研究一路都相当顺利，同事们信誓旦旦地说“冲一波，准备在2018年圣诞节前投稿”。然而，由于种种事情拖延，我们在2020年底的圣诞假期，才终于把文章投到一个两栖爬行学专刊。

在此时，突然一个“惊喜”从天而降，另有一支中国团队，也在同一片山发现了这种原指树蛙，而且还在进行描述！——气氛一下刺激起来了，要知道一个新种一旦发表，相同物种的描述就不能再发表，捷足先登者名利双收，而其他人的努力便成白费。

我们心惊肉跳地等候几个月，稿件杳无音讯，追问后，编辑坦承杂志社当前积压了一年的来稿待审……

于是我们撤回，迅速修改格式后，于2021年7月改投了MDPI旗下的一个动物科学期刊。但审稿人的评价非常负面，目的纯粹是要拒稿。期刊提出的要求，已经超出了描述新物种的范畴，但我们只得（咬着牙）按它的要求修改，增加了更高端全面的测序分析等成分。文章体量也大大膨胀，最终还是在当年底遭到拒稿。

好在，应系统动物学期刊Zookeys编辑邀请，我们在2022年稍改格式后投稿，尽管仍有一位审稿人不满意，但只用了三个月，论文就被接收了。这时，离我们发现该物种已经过去了4年。

编辑的话：

读到这里的朋友，不知道有没有注意到一个细节，杨毅老师发现新种蛙的度假村，采取“零农药”的管理方式。两栖类是受人类影响最为严重的动物类群之一，目前全球近70%的两栖类物种处于受威胁状态。栖息地丧失是影响两栖类种群的最直接因素，此外，环境污染如杀虫剂，也在破坏着它们所剩无几的栖息环境。我编辑这篇文章的时候，杨毅老师告诉我说“那里现在也喷点药了”，这只度过了三百万年沧桑的小蛙，未来将如何呢？

作者：杨毅

审稿：邓可

编辑：红色皇后

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