河豚毒素 (TTX) 是电压门控钠离子通道（NaV）选择性阻滞剂，在镇痛、 麻醉、 戒毒等神经性疾病治疗方面有潜在的医学应用前景,几十年来一直是合成化学家和药物化学家研究的热点分子。但由于没有确凿的生物合成途径，现有河豚毒素只能从野生河豚体内分离，在破坏生态环境的同时，基于河豚毒素的药物开发也一直受限于来源匮乏问题而进展缓慢。人工合成是解决河豚毒素来源问题的有力途径，然而由于结构的复杂性及物化性质的特殊性，科学界一直没有实现河豚毒素的规模化人工合成；齐湘兵实验室从廉价易得的生物质原料糠醇出发，分别以24步完成了河豚毒素TTX全合成以及22步完成河豚毒素类似物9-epiTTX的首次全合成，并且实现了目前已报道的合成的最大规模（>15mg）。
近日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院齐湘兵实验室在Nature Communications杂志在线发表了题为Total Syntheses of Tetrodotoxin and 9-epiTetrodotoxin 的研究工作。
早在明朝李时珍所著《本草纲目》中，就记有“河豚有大毒，味虽珍美，食之杀人”，然而从苏轼的“蒌蒿满地芦芽短，正是河豚欲上时”到鲁迅的 “岁暮何堪再惆怅，且持卮酒食河豚”中可看出，被誉为“长江三鲜”的美食河豚引得古今大文豪们争相“冒死得而食之”。集美味与剧毒于一身的河豚含有的这种毒素便是河豚毒素（TTX），其毒性比眼镜蛇毒毒100倍，是氰化钾毒性的1250倍，然而这类毒素又具有潜在的药用价值。
高效高选择性的电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channels，VGSC，NaV channels) 抑制剂一直是药物开发的难点，特别是在非成瘾性长效持续型镇痛药物开发方面依然尚未满足临床需求。2006年，先天性疼痛不敏感 (CIP) 患者被发现缺乏功能性NaV 1.7通道【1】，在接下来的15年里，人们热衷于开发针对NaV 1.7 通道的，具有广泛有效的镇痛效果而不会出现与阿片类药物相关的成瘾和耐受问题的选择性抑制剂。河豚毒素(TTX，Figure 1)对不同亚型的电压门控钠离子通道具有特异的抑制作用，其中，NaV1.1, 1.2, 1.3, 1.4以及1.6和1.7是TTX敏感型通道，而NaV1.5， 1.8和1.9则是TTX耐受性通道，不能被TTX阻断。TTX在动物模型中表现出显著的麻醉和镇痛特性，其作用机制被提出是通过选择性抑制NaV 1.7通道实现【2】。最近颜宁课题组通过冷冻电镜结构生物学研究解析了TTX和NaV 1.7的结合模式和详细的作用机制【3】。TTX不仅是神经生物学研究的重要工具分子，也在镇痛、 麻醉、 戒毒等神经性疾病治疗方面有潜在的应用前景【4】。临床研究发现TTX 可减轻不同神经性疼痛模型中的疼痛行为，包括神经损伤引起的神经性疼痛【5】和化疗引起的神经性疼痛【6】等，国内时杰/陆林团队的临床研究也揭示了TTX在治疗海洛因成瘾戒毒方面的显著优势【7】。然而目前为止还没有任何TTX相关适应症药物被批准上市，缓慢的临床研究不仅受限于质量可控TTX的规模化来源缺乏，同时也受高效的可提高安全窗口的给药模式限制【8】。
Figure 1: The structure of Tetrodotoxin(TTX), 4,9-Anhydro-TTX and 9-epiTetrodotoxin(9-epiTTX).
河豚毒素结构复杂，具有高度氧化的，笼状二氧杂金刚烷结构母核，杂原子高度聚集的多连续手性中心骨架。虽然独特的原甲酸与高极性胍基组成内盐两性分子导致其物化性质极其特殊难以进行常规的合成操作， 但胍类生物碱独特的生物活性（如Palau'amine，石房蛤毒素Saxitoxin, Crambescidin/Ptilomycalin A家族生物碱等）一直吸引合成化学家挑战这类分子的合成以及药物开发研究，其中具有重要的镇痛与麻醉药效以及独特而又迷人的化学结构的河豚毒素几十年来一直是科学家们心中的“明星分子”。自1972年Kishi首次完成消旋形式TTX的全合成（本文为致敬天然产物全合成以及天然药物开发大师Kishi，特意在正文中展示 Kishi的首次全合成工作）后，Isobe, Du Bois, Sato, Fukuyama, Yokoshima, Marin等一大批出色的科学家相继完成了TTX的不对称全合成【4】。值得关注的是，2022年，Dirk Trauner团队从葡萄糖衍生物（葡萄糖四步合成）出发，以22步，11%的总收率高效完成了TTX的全合成【9】。齐湘兵实验室一直致力于从可再生生物质原料及衍生物高效合成SP3原子富集的天然产物【10-13】，该研究团队从廉价易得的糠醇出发，分别以24步完成了河豚毒素TTX全合成以及22步完成河豚毒素类似物9-epiTTX的首次全合成。
在完成TTX和9-peiTTX的全合成工作后，曹鹏实验室张双峰博士，程欣宇等对合成的高纯度TTX及9-epiTTX进行了活性验证。和文献报道的一致，9-epiTTX活性较差【14】，而作者合成的高纯度TTX(S)在人类HEK-Nav1.7亚型及原代海马神经元上均表现出相对于天然分离的TTX（TTX(C)）更强的钠电流抑制。
本文研究团队以便宜易得的糠醇为原料，以24步反应完成了河豚毒素TTX的立体选择性全合成，同时以22步完成了其类似物9-epiTTX的全合成。该路线不仅可以规模化合成TTX，也为其他高度氧化的天然产物合成提供了新的思路，为基于河豚毒素的进一步药物研发提供了物质基础。
附部分审稿意见：
Reviewer1提到：“文章的价值在于有效的合成策略和潜在的规模化应用，是对这个面临临床批准并且让无数合成化学家持续着迷和挑战的传奇分子的漂亮合成”。
Reviewer 2提到：“这篇有意义的论文描述了合成 TTX 和其他高氧化多环天然产物的新工艺，这个工作是合成高难度河豚毒素分子重要的技术进步”。
Reviewer 3提到：“该文章报道了河豚毒素和 9-epi河豚毒素的非常优雅的全合成。鉴于这类分子巨大的合成难度及其重要生物学功能，所报道的合成对于天然产物化学家、合成化学家、药物化学家以及化学生物学家来说无疑是个好消息。从合成化学家角度来看，目前的合成可以媲美最近Dirk Trauner的合成（Science 2022, 377, 411-415），我很高兴看到 TTX 合成领域的蓬勃发展”。
齐湘兵实验室2017级PTN项目陈珮豪博士、2020级TIMBR项目博士研究生王静为本文第一作者，该论文的其他作者还包括齐湘兵实验室2020级PTN项目博士研究生王岩，孙毓泽博士，2020级PTN项目博士研究生白松霖，吴青翠，曹鹏实验室张双峰博士，程欣宇及曹鹏高级研究员。齐湘兵高级研究员为本文通讯作者。感谢曹鹏高级研究员及张双峰博士在钠离子通道抑制试验中做出的贡献。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-45037-0
参考文献：
1. Cox, J. J. et al. An SCN9A channelopathy causes congenital inability to experience pain. Nature 444, 894–898 (2006).
2. Narahashi, T., Moore, J. W. & Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. Journal of General Physiology 47, 965–974 (1964).
3. Shen, H., Liu, D., Wu, K., Lei, J. & Yan, N. Structures of human Nav1.7 channel in complex with auxiliary subunits and animal toxins. Science 363, 1303–1308 (2019).
4. Makarova, M., Rycek, L., Hajicek, J., Baidilov, D. & Hudlicky, T. Tetrodotoxin: History, Biology, and Synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. 58, 18338–18387 (2019).
5. Kayser, V. et al. Differential anti-neuropathic pain effects of tetrodotoxin in sciatic nerve- versus infraorbital nerve-ligated rats – Behavioral, pharmacological and immunohistochemical investigations. Neuropharmacology 58, 474–487 (2010).
6. Nieto, F. R. et al. Tetrodotoxin inhibits the development and expression of neuropathic pain induced by paclitaxel in mice. PAIN® 137, 520–531 (2008).
7. Shi, J. et al. Tetrodotoxin reduces cue-induced drug craving and anxiety in abstinent heroin addicts. Pharmacology Biochemistry and Behavior 92, 603–607 (2009).
8. Ji, T. et al. Delivery of local anaesthetics by a self-assembled supramolecular system mimicking their interactions with a sodium channel. Nat Biomed Eng 5, 1099–1109 (2021).
9. Konrad, D. B. et al. A concise synthesis of tetrodotoxin. Science 377, 411–415 (2022).
10.  http://doi.org/10.1055/a-2021-7944,
11.  https://doi.org/10.1002/anie.202304435,
12.  https://doi.org/10.1021/acs.joc.2c00015,
13.  https://doi.org/10.1002/anie.201900156
14. Yaegashi, Y. et al. Isolation and Biological Activity of 9-epiTetrodotoxin and Isolation of Tb-242B, Possible Biosynthetic Shunt Products of Tetrodotoxin from Pufferfish. J. Nat. Prod. 85, 2199–2206 (2022).
来源：BioArtMED

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